液體活檢在肺癌中的應用

賀晶晶，高俊珍

（內蒙古醫科大學附屬醫院 呼吸科，內蒙古 呼和浩特）

0 引言

肺癌是全球腫瘤相關死亡的首要原因，每年約有160 萬人死于癌癥，而每4 例癌癥死亡中就有1 例死于肺癌。考慮到50%以上的患者在初次就診和診斷時處于晚期疾病階段，肺癌在臨床、組織學和基因組學上存在著深刻的異質性，獲得足夠的組織以進行疾病的病理確認和輔助分子檢測是需要面臨的挑戰[1-2]。靶向治療的應用為晚期肺癌的治療帶來了新的希望。通過穿刺活檢對轉移性病變進行再分析是可能的，但它是侵入性有創檢查，并且采用高度異質性腫瘤組織樣本無法反映真實的疾病狀態。液體活檢，即通過分析血液樣本中的腫瘤細胞或腫瘤細胞產物，可以克服這些障礙，原則上可以反映該特定時間點存在的所有亞克隆，并允許對疾病的進展進行連續動態監測。

液體活檢最早在1974 年由Sarrell 等提出，當時指關節腔的滑液分析用于診斷滑膜疾病。而近期重新提出的液體活檢的概念，涉及通過微創方法收集體液，例如血液、尿液、滲出液或唾液，并將進行臨床試驗這項新興技術有可能繞過上述腫瘤活檢的局限性，通過分析上述樣本中的腫瘤細胞或腫瘤細胞產物，其生物標志物主要包括循環腫瘤細胞（C i r c ulating Tumor Cells, CTC）、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）、外泌體（Exosomes）、腫瘤血小板（Tumor Educated Platelets, TEP）等。通過非侵入性的取樣方法獲得腫瘤細胞信息，是輔助腫瘤治療的突破性檢測技術，是精準醫療代表性的診斷技術之一，具有實時檢測、重復取樣、微創等優點[3]。

1 循環腫瘤細胞（CTC）

循環腫瘤細胞（CTC）最早是在1869 年由澳大利亞病理學家Ashworth 首次提出，他在死亡后的患者血液中發現了與腫瘤細胞相似的細胞。CTC 是指由原發灶或轉移灶脫落進入外周血的腫瘤細胞，CTC 具有腫瘤干細胞特性，促進腫瘤及腫瘤耐藥性的形成，同時CTC 能夠發生上皮間質轉化（EMT）行為，可以使得細胞失去細胞間黏附性，同時侵襲、遷移能力增強，易于粘附于血管壁并穿越，最終產生遠處轉移。EMT 是一個復雜的過程，通過細胞接觸連接的重排，最終導致細胞粘附的喪失，從而導致細胞去分化和運動增強。在這一轉變過程中，細胞將其上皮表型部分或完全轉換為間充質表型。

EMT 是轉移瘤形成的關鍵過程，其目的是使腫瘤細胞具有更好的侵襲性和生存特性，從而促進腫瘤細胞從原發部位脫離并轉移到繼發部位；此外，EMT 可能是部分或完全的。導致CTC 的高度異質性亞群，分別具有混合上皮間質或純間質表型，單憑其免疫特性，已經經歷過任何程度EMT 的CTC可能很難與正常造血細胞區分開來，而它們在血流中的水平升高可能作為更具侵襲性疾病過程的一個指標，具有重大的預后意義高轉移潛能與耐藥性。

但是，CTC 在血液中含量少，大概每100 萬血細胞（1 mL血液）中混雜1個腫瘤細胞。因此進行CTC 研究時必須先進行富集，合理有效的富集方法就是最為重要也急需攻克的難題。主要的挑戰是如何獲得足夠數量的、最佳條件的、可用于進一步評估的CTC。

2 循環腫瘤DNA（ctDNA）

液體活檢在靶向腫瘤治療領域也產生了很有希望的結果，因為循環游離DNA（cfDNA）的分析，特別是來自腫瘤細胞的部分，即循環腫瘤DNA（ctDNA）能夠檢測特定的基因改變，作為靶向治療的潛在靶點[4]。cfDNA 和ctDNA 通過多種機制釋放到血液中，包括凋亡、壞死甚至主動脫落。ctDNA被認為能夠提供全身腫瘤的基因組圖譜，具有更廣闊的藍景。液體活檢所需的微創取樣也提供了檢測癌細胞在治療過程中發生的分子變化的機會，并監測腫瘤負擔和復發的發生。

1940 年Mandel 和Metais 首次提出了細胞外游離核酸的概念，ctDNA 是指來自腫瘤基因的DNA 片段，它隨著人體血液循環系統不斷的流動，并攜帶有基因突變、缺失、重排、拷貝數異常和甲基化等信息。一些研究報告表明，隨著疾病的進展，ctDNA 水平迅速上升，而在切除手術和/或成功的藥物治療的情況下，ctDNA 水平下降。

3 外泌體（Exosomes）

外泌體是球形納米大小的囊泡，是一類特殊的細胞外囊泡（EVs），直徑為40～100 nm，密度為1.13～1.19 g/mL。在生理和病理條件下，外泌體均可通過幾種細胞類型釋放，包括免疫細胞，干細胞和腫瘤細胞。

通常，這些納米大小的囊泡包含許多分子，包括核酸（例如雙鏈DNA 和RNA 的各種亞型），蛋白質和脂質。重要的是，供體細胞釋放的外泌體可以以自分泌、旁分泌或外分泌的方式被受體細胞吸收，這表明外泌體在細胞間通訊中的關鍵作用。在腫瘤環境中外泌體介導的交流影響了與腫瘤相關的途徑，并促進了包括肺癌在內的多種癌癥的發生和發展。腫瘤細胞外泌體在許多腫瘤生物學過程中起著重要作用。它們負責促進受體細胞的血管生成、侵襲和增殖，以促進腫瘤擴展和前轉移生態位的形成。

與正常細胞相比，外泌體的形成在腫瘤細胞中顯著改變。此外，盡管外泌體從所有細胞類型中釋放出來，但外泌體在腫瘤細胞中高度豐富。在肺癌患者中，發現體液中的外泌體水平上調，表明外泌體在肺癌發展和進程中的關鍵作用。

與其他液體活檢方法（如CTC 和ctDNA）相比，外泌體更可能反映細胞間通訊的作用，此外與CTC（1-10 CTC/mL血液）相比，腫瘤細胞外泌體釋放是一個活躍的過程，血液中的泡數≥109個/mL，此外外泌體還敏感地反映腫瘤的狀態，從而使外泌體更好地替代腫瘤的液體活檢。盡管基于外泌體的肺癌液體活檢策略在臨床應用中具有很大的潛力，但在目前階段，還是存在一些局限性，應將機制研究和臨床研究更好地結合起來。

4 腫瘤培養血小板

液體活檢的另一類新成分是腫瘤培養血小板（TEP）。這些無核的細胞碎片在外周血中形成第二種最豐富的細胞類型，可以通過轉移與腫瘤相關的生物分子（主要是RNA）來受腫瘤細胞的教育。TEP 參與了多個實體腫瘤的進展和擴散，拼接的TEP-RNA 替代信號可以提供關于腫瘤存在、位置和分子特征的特定信息[5]。

傳統上以止血作用著稱的血小板在腫瘤的生長發育過程中也起著顯著的作用。在與腫瘤細胞對抗的過程中，腫瘤相關分子可以轉移至血小板內，最終形成TEP。

在癌癥發生期間，血小板對癌細胞以及進入血液的癌細胞都有影響。首先，血小板通過向腫瘤提供多種促血管生成因子，如vegf、pdgf 和bfgf，并刺激這些因子的表達，創造支持新生血管形成的環境。其次，血小板減少局部腫瘤細胞凋亡和失活，并能通過直接的物理作用和釋放TGF-β 分子誘導腫瘤細胞的上皮-間質轉換。隨后，血小板保護循環中腫瘤細胞免受正常免疫反應。心臟病患者使用的血小板聚集抑制劑，如氯吡格雷等，這些藥物針對血栓形成所必需的受體（例如二磷酸腺苷受體），發現它們也主要通過調節腫瘤細胞/血小板相互作用和血管生成而影響導致癌癥進展的機制。因此，血小板介導了腫瘤進展和癌癥的全身擴散的關鍵步驟。

據報道，升高的預處理血小板、淋巴細胞比例與對nivolumab 抗PDL1 免疫療法的應答率降低相關，表明在存在抗腫瘤免疫應答的情況下，循環中的血小板可能會增強促癌作用。有趣的是，還顯示血小板可以浸潤在腫瘤組織中，表明血小板可以連續地定植并從腫瘤微環境中疏散。

除了檢測癌癥外，還對TEP 進行了研究以監測癌癥的進展。隨著TEP 螯合腫瘤來源的RNA 分子，包括EML4-ALK融合轉錄本，已顯示出有效的抗EML4-ALK crizotinib 治療對NSCLC 患者降低了循環TEP 中EML4-ALK 轉錄本的數量。由于正常血小板的壽命約為7～10 d，因此腫瘤衍生的轉錄本可以在TEP 中積聚并受到循環血漿衍生RNA 酶的保護，因此可以預期TEP RNA 分析會揭示出高表達的腫瘤最新活動和反映其動態。已有研究表明，NSCLC 通過釋放pf4 促進血小板生成，然后血小板進入肺和腫瘤實質。

較CTC，腫瘤血小板更加豐富。但是目前分析的樣本數量相對較少，算法過度擬合的風險較高，獲得TEP 的技術仍在發展。

5 展望

液體活檢已經發展成為一個非常活躍的研究領域，尤其是CTC 和ctDNA 作為生物標志物受到了廣泛的關注。盡管取得了重要進展，但液體活檢的臨床應用仍處于爭論之中，一些技術挑戰仍有待解決，其在早期癌癥檢測方面的應用仍然是一個巨大的挑戰。總之，本文所述的各種液體活檢平臺可能在癌癥患者的治療中相互補充。連續地實時液體活檢將有可能早期識別個體患者對癌癥治療的抵抗力，作為個體化癌癥醫學的重要標志。