復發性自然流產與胚胎停育患者染色體異常狀況分析

王蕾 王艷麗 張超楠 李樂瑤

（河南省人口和計劃生育科學技術研究院，國家衛健委出生缺陷預防重點實驗室，河南人口缺陷干預技術研究重點實驗室，河南 鄭州 450002）

研究發現，因胚胎停育所引起的自然流產占妊娠總數10%~20%，對患者身心健康造成嚴重影響[1]。遺傳因素是導致自然流產主要原因之一，主要包括非整倍體、多倍體等染色體各種畸變，臨床尚無有效藥物解決遺傳因素，進而導致患者出現反復流產及不孕不育等。以往臨床常通過傳統核型分析、熒光原位雜交（Fluorescence in site hybridization，FISH）等技術對染色體異常進行檢測，雖然具有一定檢測效果，但無法定位部分結構異常的核型，且無法明確多余染色體來源，效果不理想[2]。多重連接依賴式探針擴增技術（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）是一種新型生物學診斷技術，具有省時省力、成本低、檢出率高等優點，可快速準確檢測染色體非整倍體，彌補常規檢測不足[3]，然而目前臨床對其在自然流產中的研究并不多見。本研究通過MLPA技術分析復發性自然流產與胚胎停育患者染色體異常狀況，旨為臨床提供遺傳病病因資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用回顧性分析法，收集2018年6月至2019年10月本院不孕不育及優生遺傳門診收治的300例復發性自然流產或胚胎停育患者臨床資料，患者年齡23~51歲，平均年齡32.13±3.06歲；體質量45~74 kg，平均52.31±2.03 kg；孕周7-18 w，平均10.32±2.06 w；其中198例復發性自然流產，102例胚胎停育患者。

1.2 入選標準

1.2.1 納入標準

①所有患者均符合《婦產科學》[4]中復發性自然流產或胚胎停育的診斷標準；②所有患者臨床資料及標本資料均完整；③患者對本次研究資料采集及閱覽知情；④無精神疾病或認知功能障礙者；⑤無嚴重母血污染或無結果的標本。

1.2.2 排除標準

①合并嚴重心、肝、腎等重要臟器病變者；②孕期合并感染性疾病或免疫系統疾病；③合并子宮肌瘤或者子宮畸形等子宮異常者；④合并惡性腫瘤者；⑤合并凝血功能障礙者。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

采用專用眼科剪以及鑷取患者絨毛組織，約1/3黃豆大小，以蒸餾水反復沖洗后，盡量剪碎臍帶等組織，加入1%樹脂Chelex-100溶液（美國伯樂公司）80 μl及蛋白酶K（賽默飛世爾科技有限公司）30 μl，震蕩5-10 min；沸水煮10 min，震蕩后冷凍并離心10 min。

選取上清液作為所取DNA。選取1 μl上清液用于核酸蛋白分析儀（型號：Thermo nana droP 2000，公司：自賽默飛世爾科技有限公司）的檢測（超過25 μg?μl-1）。

1.3.2 MLPA檢測法

將3 μl的DNA98℃變性處理10 min，降到室溫后，加入1.5 μl（0.75 μl探針混合液及0.75 μl緩沖液）探針混合液， 60℃靜置16-24 h，待聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（型號：Bio-Rad DNA Engine，美國伯樂公司）降至54℃時，加入16 μl連接酶混合物。54℃溫浴20 min，并加熱5 min將連接酶滅活，加入PCR反應液（3.75 μl H2O+1.0 μl PCR引物+0.25 μl DNA聚合酶）；分別于90℃、60℃中放置30 s，72℃中1 min，進行34個循環。取3 μl的PCR產物及20 μl甲酰胺（由美國Promega公司提供），利用毛細管電泳技術進行分離，其結果對應峰在0.7-1.3之間則拷貝數正常；雜合性缺失：0.3≤對應峰≤0.7；雜合性重復：1.3≤對應峰≤1.7。

2 結果

300例標本中，染色體非整倍體異常有158份（52.67%）；三體及部分單體共133份，占所有染色體異常的84.18%。

異常比例前五位為：16三體36份（12.00%）；X0單體17份（5.67%）；22三體12份（4.00%）；13三體9份（3.00%）；21三體8份（2.67%）。性染色體中，三體4份（1.33%）（其中XXY或XYY共3份，XXX1份）。部分三體11份（3.67%），其中17染色體最多；部分單體9份（3.00%），以8及12染色體最多；同源染色體不平衡易位2份（0.67%），其中以(8p-，8q+)易位最常見（2份）；非同源染色體不平衡易位3份（1.00%）。

3 討論

自然流產及胚胎停育是婦科常見疾病，對育齡女性身心健康造成嚴重威脅。尋求妊娠失敗的原因，對提高患者下一次妊娠成功率具有重要意義。近年來流行病學研究顯示，胚胎停育及自然流產的發病率呈不斷上升趨勢，占早孕婦女10%-20%左右[5]。研究表示，胚胎停育及復發性自然流產病因較為復雜，其中染色體異常被臨床認為是疾病發生的主要原因之一。國外相關研究表示，染色體非整倍體是造成人類胚胎低著床率及早期流產的重要原因[6]。可見，給予自然流產及胚胎停育患者進行染色體檢查十分必要。

人體中共有22對常染色體及1對性染色體，且男女的性染色體不同，男性是由1個X性染色體及Y染色體組成，而女性則有2個X性染色體。本研究表1通過觀察300例標本在23對染色體中異常染色體數目情況，以分析復發性自然流產與胚胎停育患者染色體異常狀況。既往研究表示，胚胎染色體異常是造成自然流產及胚胎停育主要原因，停止發育的胚胎染色體異常率達到50%-70%，其主要異常形式為染色體非整倍異常，占總數的80%以上，其次為染色體的結構異常，這也與本研究結果相似[7]。以往臨床常通過傳統核型分析、FISH等技術對染色體異常進行檢測，其中傳統核型分析是檢測染色體異常金標準，但其較為繁瑣，家屬要求高，普及難度大且對標本要求高，對于胚胎停育患者，若胚胎死亡時間較長，容易導致培養失敗。FISH技術是針對未經培養的細胞檢測，對標本研究較低，且操作相對簡單，可快速得到結果，但無法定位部分結構異常的核型，效果不理想[8]。本研究通過MLPA技術檢測，可彌補以往常規方法不足，效果較好。研究表示，染色體數目異常中各種三體綜合征較多見，三體通常是母體減數分裂過程中，同源染色體不分離，導致子細胞中的染色體發生重復[9]。

本研究結果顯示，300例標本中，染色體非整倍體異常有158份（52.67%），這已達到采用比較基因組雜交及下一代測序方法檢測流產絨毛的異常率。本研究中三體及部分單體共133份，占所有染色體異常的84.18%，其中16三體占12.00%，這與Saxena等[10]研究結論相似。此外，本研究中21、13、22三體染色體較為多見，19及17號染色體較少出現非整倍體異常，且1號染色體未發現非整倍體異常，提示染色體非整倍體異常常發生在16號染色體中，且部分缺失或者重復及不平衡易位均有可能發生，臨床應重點關注。但本研究因納入樣本量有限，研究結果仍需臨床加大樣本量進一步證實。

綜上所述，采用MLPA法檢測復發性自然流產與胚胎停育患者染色體，具有高效、快捷等優點，染色體非整倍異常是導致復發性自然流產與胚胎停育的主要因素，其中16號染色體最為常見。