約氏瘧原蟲絲/蘇氨酸磷酸酶5抗血清對有性階段生長抑制作用的研究①

周 丹 于園超 洪明陽 朱曉彤 崔立旺

(中國醫科大學免疫學教研室，沈陽 110122)

蛋白質可逆磷酸化修飾是存在于所有生物體的重要生理機制，在細胞信號通路傳導和細胞周期調控中至關重要。蛋白質磷酸化和去磷酸化過程分別由激酶和磷酸酶調控。近年來磷酸化修飾中相關蛋白磷酸酶和激酶已作為藥物靶點進行廣泛研究[1，2]。蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatases，PPase)根據序列同源性和三維結構相似性可分為絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(phosphoserine and phospho-threonine residues phosphatases，PPPs)、Mg2+依賴的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PPMs)和酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPs)3個家族[3]。PPPs的主要成員包括：PP1、PP2A、PP2B和PP7等[4，5]。惡性瘧原蟲PP1和PP2A在紅內期表達，且PP1可影響瘧原蟲DNA的合成[6]；惡性瘧原蟲PP7在不同階段表達水平具有明顯差異：在早期滋養體中幾乎不表達，在晚期裂殖體階段表達水平達到峰值[7]。

絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶5(PP5)屬于PPP家族成員，PP5的主要結構特征包括高度保守的PP2Ac結構域以及四肽重復序列(TPRs)的N末端延伸，這3個四肽重復序列是PP5蛋白特有的[8，9]。TPR結構域由一系列反平行的α螺旋組成，它們通過疏水相互作用聚集在一起形成一個搖籃狀的溝槽，被認為參與了許多重要調節蛋白的結合，如熱休克蛋白90(heat shock proteins 90,Hsp90)[10，11]。TPR和蛋白C端可形成環形結構，抑制PP2Ac結構域功能，因此在PP5蛋白發揮去磷酸修飾時起調控作用。已有研究表明，PP5在多種原蟲生長過程中起作用：PP5表達水平降低可導致柔嫩艾美耳球蟲原蟲(eimeriatenellaPP5，EtPP5)二代裂殖子凋亡[11]；敲除布魯氏錐蟲PP5(trypanosomabruceiPP5，TbPP5)基因可抑制錐蟲生長[7]；伯氏瘧原蟲(plasmodiumbergheiPP5，PbPP5)基因缺失可抑制有性階段發育[12]；惡性瘧原蟲PP5(plasmodiumfalciparumPP5，PfPP5)在紅內期表達，并與Hsp90相互作用[13]。綜上，PP5蛋白在原蟲生長發育中具有重要作用。

鑒于PP5蛋白在各種屬原蟲生長發育中發揮的重要作用，本文通過生物信息學方法預測約氏瘧原蟲PyPP5(Py04697)優勢抗原表位，擴增后克隆至原核表達載體，獲得PyPP5重組蛋白后免疫小鼠獲得抗血清。觀察發現，PyPP5蛋白具有免疫原性和免疫反應性。同時，抗-PyPP5免疫血清在體內外均具有傳播阻斷效果。上述研究結果為高效瘧原蟲傳播阻斷疫苗的研發奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料 BALB/c小鼠(6～8周齡，雌性)；約氏瘧原蟲基因組DNA(gDNA，中國醫科大學免疫學教研室)；KOD-Plus(Toyobo)；FastDigest BamHⅠ(Thermo Fisher Scientific)；FastDigest NotⅠ(Thermo Fisher Scientific)；ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(Vazyme)；快速質粒小提試劑盒(TIANGEN)；LB Broth(Solarbio)；RPMI1640(Gibco)；TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit v2.0(TaKaRa)；PierceTMECL Plus Western blot Substrate、HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads、6×His Tag Monoclonal Antibody,HRP(Thermo Fisher Scientific)；胎牛血清(Hyclone)。

1.2方法

1.2.1約氏瘧原蟲絲/蘇氨酸磷酸酶5(Py04697，PyPP5)基因合成及原核表達載體構建 以約氏瘧原蟲gDNA為模板擴增PyPP5目的片段，瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收純化。pET32a(+)原核表達載體經BamHⅠ和NotⅠ限制性內切酶37℃孵育2 h后，采用Exnase Ⅱ(Vazyme)重組酶與純化后的PyPP5目的片段37℃ 30 min進行重組反應。將連接后的pET32a(+)-PyPP5表達載體轉化入感受態細胞中，篩選酶切鑒定和測序正確的陽性克隆株進行rPyPP5誘導。

1.2.2重組蛋白的表達、純化與抗血清的制備 挑取pET32a(+)-PyPP5陽性克隆加入 LB培養基(500 ml)中，37℃搖至OD值為0.2～0.4，加入1 mmol/L IPTG 19℃過夜誘導。9 000 r/min離心5 min收菌，沉淀用8 ml天然結合緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4·2H2O，30 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH8.0)吹打混勻后超聲。超聲開3 s，關9 s，5 min/次，共4次，冰上進行。超聲后12 000 r/min離心15 min，收集上清中可溶性蛋白。采用HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads純化PyPP5重組蛋白(rPyPP5)。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化后的PyPP5重組蛋白，考馬斯亮藍染色檢測蛋白表達和純化情況。免疫血清制備：6～8周齡BALB/c雌性小鼠20只，PBS免疫組和rPyPP5免疫組各10只。初次免疫中，rPyPP5(50 μg/只)與完全弗氏佐劑使用三通管充分混合后皮下免疫小鼠。兩周和四周后進行二免和三免，rPyPP5與不完全弗氏佐劑使用三通管充分混合后皮下免疫。三免后第10天眼球取血獲取抗-PyPP5免疫血清。

1.2.3ELISA檢測抗-PyPP5免疫血清中特異性抗體滴度 采用10 μg溶解在碳酸鹽緩沖液中的rPyPP5包被96孔酶標板，4℃過夜。PBS-T洗6次后，將免疫血清從1∶1 000稀釋至1∶256 000，每孔加入100 μl，37℃孵育2 h后PBS-T洗3次，加入HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)，37℃孵育1 h后PBS-T洗6次，加入鄰苯二胺和H2O2進行反應，加入濃硫酸終止反應，波長492 nm處檢測OD值。

1.2.4提取約氏瘧原蟲不同階段的蛋白 采用1×107個Py 17XL活蟲感染昆明鼠。裂殖體純化：感染后第3天無菌心臟取血，加入到裂殖體培養基(25%胎牛血清+RPMI1640+鏈霉素+青霉素)中，37℃培養20 h。培養后用55%的Nycodenz，2 500 r/min離心30 min，分離純化成熟裂殖體。環狀體純化：純化后的裂殖體尾靜脈回輸至小鼠體內，涂片觀察。至環狀體時，采用80%的Nycodenz 進行純化。滋養體純化：純化后的裂殖體尾靜脈回輸至小鼠體內，涂片觀察。至滋養體時，采用70%的Nycodenz 進行純化。配子體純化：感染后第3天喂食磺胺嘧啶(20 mg/L)，48 h后采用48%的Nycodenz分離純化配子體。動合子純化：感染后第3天，心臟采血，1 ml全血加9 ml動合子培養基(25%胎牛血清+RPMI1640+鏈霉素+青霉素，pH8.3)，19℃，24 h體外進行動合子培養后，采用62%Nycodenz 分離純化動合子期原蟲。蛋白提取：上述純化后各階段約氏瘧原蟲用0.15%saponin冰上裂解8 min，13 000 r/min離心5 min，PBS-PI清洗至上清無紅色(去除血紅蛋白)，向沉淀中加入適量的M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(ThermoFisher)。采用Western blot方法檢測約氏瘧原蟲各階段蛋白的表達情況。

1.2.5抗-PyPP5免疫血清對原蟲有性階段生長抑制作用的觀察 采用1×107個Py 17XL活蟲感染已連續腹腔注射苯肼(200 μl；6 mg/ml)2 d的BALB/c小鼠。感染后第3天，將1∶5倍稀釋的rPyPP5/PBS免疫的小鼠血清加入動合子培養基(25%胎牛血清+RPMI1640+鏈霉素+青霉素)中，25℃條件下，尾血與動合子培養基1∶4混合培養15 min，培養結束后取1 μl混合液涂片，在光學顯微鏡下計數配子體出絲數。取10 μl尾血加入90 μl動合子培養基中(培養基中加入1∶5倍稀釋的rPyPP5/PBS免疫的小鼠血清)，19℃培養24 h后，取1 μl涂片，用4%多聚甲醛和0.007 5%戊二醛固定。抗-Pys25(1∶200)室溫孵育90 min，羊抗鼠Alexa fluor 488抗體(1∶500)室溫避光孵育60 min。采用熒光顯微鏡計數動合子數目和動合子轉化率。蚊飼實驗：直接蚊飼實驗前1 h，rPyPP5免疫組和PBS免疫組分別尾靜脈注射100 μl抗-PyPP5免疫血清和PBS免疫血清，蚊飼2 h，7 d后解剖蚊胃計數卵囊數量。

1.3統計學處理 實驗數據采用GraphPad Prism 6.01統計軟件進行分析。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1重組蛋白表達純化及免疫血清特異性IgG抗體滴度檢測 本研究中通過Infusion克隆方法成功構建了pET32a (+)-PyPP5原核表達載體。SDS-PAGE電泳分析可見rPyPP5(約50.4 kD)的表達，蛋白大小與預測蛋白分子量一致(圖1A)。ELISA檢測結果顯示，應用rPyPP5免疫小鼠收集的血清與對照組相比，抗體特異性水平升高，且抗-PyPP5免疫血清抗體滴度在1∶128 000時與對照組有顯著差異(P<0.05，圖1B)。

圖1 rPyPP5表達檢測及免疫血清ELISA結果Fig.1 Expression of recombinant rPyPP5 and ELISA results of immune serumNote:A.Detection of recombinant rPyPP5 by coomassie brilliant blue staining；B.ELISA results of anti-serum obtained by immunizing mice with recombinant rPyPP5.PBS.Anti-serum obtained by PBS immunization;PyPP5.Anti-serum obtained by immunizing mice with recombinant Plasmodium yoelii PP5 protein.*.P<0.05；**.P<0.01.

2.2PP5在約氏瘧原蟲各階段的表達情況 提取約氏瘧原蟲不同階段的蛋白質進行SDS-PAGE分離，并用抗-PyPP5免疫血清進行檢測。結果顯示，約氏瘧原蟲PP5蛋白在環狀體、滋養體、裂殖體、配子體、動合子等階段均有表達，且在裂殖體期表達達峰值(圖2A)。采用抗PyPP5免疫血清進行的約氏瘧原蟲各發育階段的免疫熒光檢測結果顯示：PP5蛋白在環狀體、裂殖體、配子體和配子階段定位于原蟲胞漿(圖2B)。

圖2 PyPP5各階段表達和定位情況Fig.2 Expression and location of PyPP5 at each develop-ment stageNote:A.Western blot of Plasmodium yoelii cell lysates with anti-PyPP5 serum.R.Ring;T.Trophozoite;S.Schizont;G.Gametocyte;O.Ookinete.Positions of pre-stained molecular mass markers are indicated.Western blot with anti-Hsp70 serum is shown as loading controls.Arrows indicate PyPP5 and Hsp70 proteins，respectively.Lower panel shows the bands intensity of PyPP5 protein at each stage.Signal intensity was normalized by Hsp70 results.B.Localization of PP5 proteins at Plasmodium yoelii each develop-ment stage.

2.3抗-PyPP5免疫血清對有性階段原蟲的作用 體外免疫血清抑制實驗顯示，抗-PyPP5免疫血清使配子體出絲數目減少29.89%(P<0.05，圖3A)，與PBS免疫血清相比差異具有統計學意義，提示抗-PyPP5免疫血清對雄配子體出絲有抑制作用。

瘧原蟲動合子培養基中加入1∶5倍稀釋的抗-PyPP5免疫血清與瘧原蟲培養24 h后可觀察到動合子形成減少，動合子數目減少38.59%(P<0.05，圖3B)。同時，經過1∶5倍稀釋的抗-PyPP5免疫血清使動合子轉化減少64.30%(P<0.01，圖3C)。上述結果提示抗-PyPP5免疫血清對動合子的形成和成熟有抑制作用。

與PBS免疫血清相比，吸食過繼免疫-PyPP5免疫血清小鼠血液的蚊卵囊數目減少70.23%(P<0.001，圖3D)。吸食過繼免疫-PyPP5免疫血清小鼠血液的蚊感染率下降7.14%(表1)。上述結果提示抗-PyPP5免疫血清對蚊胃內卵囊形成有抑制作用。

圖3 抗-PyPP5免疫血清對有性階段原蟲的作用Fig.3 Effect of anti-PP5 serum on sexual stageNote:A.Effect of anti-PyPP5 serum on male gametocyte exflagellation；B.Effect of anti-PyPP5 serum on ookinete number；C.Effect of anti-PyPP5 serum on ookinete conversion rate；D.Effect of anti-PyPP5 serum on oocysts formation.PBS.Anti-serum obtained by PBS immunization;PyPP5.Anti-serum obtained by immunizing mice with recombinant Plasmodium yoelii PP5 protein.*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

表1 抗-PyPP5免疫血清傳播阻斷效果Tab.1 Transmission blocking effect of anti-PyPP5 serum

3 討論

蛋白質磷酸化在瘧原蟲有性生長發育階段具有重要作用[7]。蛋白磷酸酶由PPP、PPM和PTP三個基因家族編碼[13]。PP5屬于PPP家族成員，具有多種功能，包括類固醇信號轉導、MAP激酶級聯的衰減以及調節細胞周期等[14]。PP5在約氏瘧原蟲中的功能尚未有研究報道。

傳播阻斷疫苗(transmission blocking vaccine，TBVs)經典候選抗原，包括受精前的靶抗原如P48/45、P230，受精后的靶抗原P25以及蚊蟲中腸靶抗原[15]。P48/45傳播阻斷效果明顯，但其在體外無法形成正確空間結構而導致研究受阻。惡性瘧原蟲Pfs230抗體可在蚊胃阻斷瘧原蟲的發育，但是其阻斷活性依賴于補體，補體失活時，Pfs230抗體的阻斷活性消失[16，17]。受精后靶抗原P25為動合子表面蛋白，具有很強的免疫活性，但其存在有限的抗原多態性[18]。本研究發現，約氏瘧原蟲PP5重組蛋白免疫血清具有良好的免疫原性和抗原性，提示約氏瘧原蟲PP5蛋白可作為傳播阻斷疫苗候選抗原。有研究發現，伯氏瘧原蟲PP5免疫血清1∶5倍稀釋時可使配子體出絲數目和動合子轉化率減少[19]。而在本研究中，約氏瘧原蟲PP5免疫血清1∶5倍稀釋時使配子體出絲率和動合子轉化率分別下降29.89%和64.30%。上述研究結果提示，約氏瘧原蟲PP5免疫血清對配子體出絲、部分動合子的形成和成熟均有抑制作用。同時，本研究發現PyPP5免疫血清對蚊胃內卵囊形成有抑制作用。以上結果說明PyPP5免疫血清對約氏瘧原蟲有性階段的生長發育有抑制作用。

綜上所述，本研究采用原核表達技術獲得約氏瘧原蟲PP5蛋白，并制備PyPP5特異性免疫血清。另外，本研究通過體外抑制實驗證實PyPP5免疫血清可以有效抑制有性階段原蟲的生長發育，從而為TBVs的研發提供了一定的實驗基礎。