TB/HIV患者血漿蛋白組織學研究進展

哈斯來提阿依·買買提，胡昕，齊曼古力·吾守爾

（新疆醫科大學第一附屬醫院呼吸科，新疆 烏魯木齊）

0 引言

結核?。╰uberculosis，簡稱TB）是由結核分枝桿菌[1]（Mycobacterium tuberculosis，MTB,俗稱結核桿菌）感染引起的嚴重危害人類身心健康的呼吸道傳染性疾病。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）數據顯示[2]，2017年全球潛伏結核感染者17億，其中新發病例1000萬，死亡例數130萬。我國新發病例數88.9萬，占全球新發病例8.89%，僅次于印度尼西亞（2740萬例），排列第二。其中結核病合并艾滋病雙重感染人群達90萬，死亡例數30萬，占全球結核死亡例數23.08%。艾滋病是由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV)侵入人體后攻擊和殺傷免疫細胞，破壞機體免疫系統功能而引起的獲得性自身免疫缺陷綜合癥（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS）。機體免疫缺陷、免疫系統功能破壞常增加機會性感染風險，其中結核病（tuberculosis，TB）最常見，是正常人群30倍[3]。據文獻報到[4]，1/8新發結核病患者發生在HIV陽性者中。HIV陽性者中潛伏性結核桿菌感染者發展成活動性肺結核可能性比HIV陰性者高20-30倍。TB/HIV雙重感染患者因免疫力極度低下、臨床癥狀不典型、各項輔助檢查陽性率低、早期發現及診斷困難，導致疾病疫情居高不下。對于TB/HIV雙重感染患者，現有的防治規劃難以滿足大量患者的需要，實際需求與診治方案不相適應，這就迫使醫療盡快拿出一套針對特殊結核?。═B/HIV）人群行其有效的結核病防治策略。

1 血漿蛋白組織學概述

隨著生物技術的發展，研究者們將TB診斷的重點開始轉向能反映機體狀態的蛋白質組學研究。1991年Nagai等[5],首次應用雙向電泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）技術，對MTB H37Rv菌株2—10周培養濾液中的蛋白質進行分離鑒定，拉開MTB蛋白質組學研究的序幕。

血漿蛋白組學本質上是指在大規模水平上研究血漿中蛋白質特征的一門學科。當機體受刺激或生理功能發生變化時，血清蛋白也隨著出現相應變化。經研究發現，含量少于1%的低分子量蛋白質分子（分子量小于10ku）是與疾病相關的組織病理信息載體，疾病時釋放到血液循環中。血清蛋白質組學作為一種整體、動態、定性、定量、全面分析蛋白質功能、組成以及相互關系的一門學科，發現疾病相關的血清蛋白標志物有重大意義。蛋白質組學技術是指使不同水平的蛋白質能夠同時分離和鑒定的技術。包括蛋白質分離技術，如iTRAQ技術[6]及非標記技術[7]。蛋白質鑒定技術，如基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜[8]（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術，電噴霧串聯質譜[9](electrospray tandem mass spectrometry，ESI-Ms/Ms)技術等。其中，iTRAQ-2DLC-MS/MS技術因分離能力強、分析范圍廣、靈敏度高、特異性高、檢測限低、自動化程度高等諸多優點，受研究人員關注并廣泛使用。因血漿蛋白組學以上特點，目前越來越研究者將開始運用血清蛋白組織學技術來尋求疾病與之相關靶蛋白關系，為疾病早期發現、診斷提供充足的診斷依據。目前國內外研究者利用不同蛋白組織學技術探索研究宮頸癌[10]、口腔鱗狀細胞癌[11]、肝細胞癌[12]、急性淋巴細胞白血病[13]等多種疾病的生物標志物。

2 血漿蛋白組學在疾病中應用

2.1 血漿蛋白組織學在不同結核病中應用

Jiang等[6]，選取136名肺結核患者及66名健康人群血清標本,進行脫鹽、濃縮、還原、消化等處理，iTRAQ同位素標記聯合2DLC-MS/MS技術對樣本進行分析。最終在TB和健康組中獲得79種差異蛋白（51種上調蛋白，28個下調蛋白）。這些蛋白質功能多樣，參與機體生物調節、細胞代謝、參與補體凝血連鎖通路、感受器相互作用等功能。綜合考慮倍數變化率，蛋白功能等因素，最終選維生素K依賴蛋白Z（Human vitamin K-dependent protein Z ，PROZ),淀粉樣蛋白A（Serum Amyloid protein A，SAA）和C4b結合蛋白β鏈（Human C4b-binding protein beta chain，C4BPB），用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbet assay,ELISA)法對差異蛋白行后續驗證，構建含有驗證蛋白質的TB決策樹。得出該診斷模型準確率97.2%，敏感性97.06%，特異性95.45%。因此，認為SAA，PROZ和C4BPB可能是肺結核的新型潛在診斷性生物標志物。Xu等[14]，將TB患者及健康人血清進行iTRAQ-2DLC-MS/MS分析比較,獲得載脂蛋白II（Apolipoprotein II，APOCII)、人CD5分 子 樣 蛋 白(Human CD5 molecular protein，CD5L)、重組人視黃醇結合蛋白（Recombinant human retinol binding protein，RBP4)含量在TB患者血清中顯著升高。以蛋白質構成最優分類樹診斷模型，該模型篩檢敏感度、特異度分別為93.42%，92.86%，對于區分TB與健康人有價值。Wang等[15]，運用 iTRAQ-2DLC-MS/MS技術研究MDR-TB患者血清中 CD44、激肽原1重組蛋白（Recombinant Kininogen 1,KNG1）等蛋白含量與健康人群相比明顯升高，可作為潛在的MDR-TB診斷標志物。胡水秀等[16]，用采用同位素標記結合MALD-TOF/MS技術篩選涂陰結核患者血漿蛋白組織學監測，共發現18中差異表達蛋白。Wang等[17]，對規律抗結核治療后患者及健康對照組血清進行分析，最終發現白蛋白,解離抑制因子β,補體C3,纖維黏膠蛋白2，脂蛋白a水平較健康人群中顯著升高，建立其診斷模型,靈敏度87.1%,特異度79.49%,且準確度為87.6%。認為這五種蛋白可能是治療后結核病患者血清蛋白標志物。Liu等[18]，將該技術與弱陽離子交換磁珠相結合，對痰涂陰肺結核患者和健康人血清進行檢測，發現3個具有顯著性差異的蛋白峰，峰值分別為2747、4480、9410。以此建立分析模型對診斷涂陰肺結核患者的靈敏度83.33%,特異度82.50%。

2.2 血漿蛋白組學在TB/HIV雙重感染人群中應用：

Chen 等[19]，對TB/HIV與單純HIV兩組人群血清應用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術進行分析，發現25中表達差異蛋白。其中，7種蛋白表達下調，18種蛋白表達上調。并對差異表達蛋白用ELISA法驗證，最終發現內皮糖蛋白（ENG）重組蛋白在雙感患者血漿中表達上升至10倍以上。認為ENG蛋白是結核合并艾滋病患者特意血漿蛋白標志物。

3 結論

結核病是是艾滋病毒攜帶者的頭號殺手。艾滋病病毒通過擴大潛伏結核重新激活的風險、增加一旦感染結核桿菌再次發生結核感染的可能性以及提高感染后立即迅速進展的危險，極大地重塑了結核的流行病學。MTB感染可加劇HIV感染的病程。有報道指出，機體感染MTB后可誘導疾病相關細胞因子的釋放，這些因子可增加HIV的復制。HIV合并結核桿菌感染促進彼此進展，加快機體免疫功能下降速度。兩者合并可產生“1+1＞2”的嚴重后果。HIV/TB 臨床癥狀及影像學表現特征不典型、實驗室檢查結果陽性率低，故早期診斷較困難。

蛋白組學研究已有上百年歷史，發展至今已日趨成熟，它是對整個基因組在不同時空編碼的全部蛋白質的組成和活動規律的研究，并在組織細胞的整體蛋白質水平上揭示生命活動的基本規律，獲得對細胞生理、病理過程及調控網絡的全面、深入的認識。近幾年，隨著生物技術的發展，越來越多的學者試圖尋求快速、準確的結核病診斷方法。經血漿蛋白質組學技術發現的血漿蛋白標志物以高靈敏度和特異度開始受國內外學者關注。值得關注的是，MTB可導致血清TB相關蛋白水平變化。他們將利用血漿蛋白組織學技術鑒定并分析血清中與疾病相關特異蛋白質變化水平，為早期診斷提供可靠的理論依據。TB/HIV雙重感染患者作為常見的結核特殊人群，免疫力極度低下，導致各項實驗室檢查結果陽性率低，故研究者開始應用血漿蛋白組織學技術探索血漿特異蛋白標志物。但目前國內外相關研究甚少，需進一步探索。TB/HIV患者血清蛋白組學研究結果初步顯示，運用蛋白組織學技術鑒定、分析TB/HIV相關血清蛋白標志物。但是這些血漿蛋白標志物距離臨床應用還需要很長一段時間，需要科學工作人員不斷探索新型技術。