電針預處理對MCAO大鼠腦保護機制的研究進展

程愛芳，張英杰，陶苗苗，徐鳴曙

(1.上海中醫藥大學，上海 201203;2.上海市針灸經絡研究所，上海 200030)

卒中目前在我國處于高發態勢，其中缺血性卒中占全部卒中的70%左右[1]。缺血性卒中發生后患者不同程度地喪失其勞動及生活自理能力，給家庭和社會帶來巨大負擔。目前，對于缺血性卒中的預防更多地處于基礎研究階段，主要研究對象基于大腦中動脈阻塞模型(middle cerebral artery occlusion， MCAO)大鼠，主要預處理方式包括針刺預處理、藥物預處理、高壓氧預處理、遠隔缺血預處理等，研究表明預處理方式可在一定程度上誘導腦缺血耐受[2-4]。

電針療法作為綠色療法的一部分，被越來越多地應用和研究[5]。有報道顯示，電針預處理大鼠“百會”可使大鼠腦缺血后神經功能減退得到改善，腦梗死面積減小，并提出“電針預處理”的概念[6]。此后，有關電針預處理的報道不斷出現[7-8]。然而，對于電針預處理的腦保護機制仍不甚明確，本研究希望通過歸納現有文獻中有關電針預處理腦保護機制的研究，為今后電針預處理的臨床應用提供科學依據，現報道如下。

1 減輕炎癥反應

對于機體而言，適度的炎癥反應可以殺菌、清除和修復損傷組織，而過度的炎癥反應則會加重患區的潰爛及功能衰減甚至喪失。有研究顯示，在 MCAO術后，再灌注損傷導致炎癥反應發生，過度的炎癥反應致使傷口難以愈合，并且加重了實驗中動物梗死的發生及神經功能缺陷，而炎癥反應又進一步加重了腦缺血再灌注損傷[9]。腦缺血后，白細胞、小膠質細胞被激活并釋放大量的細胞因子，這些物質在腦缺血再灌注損傷的過程中發揮了重要作用[10]。

1.1 白細胞及相關細胞因子

急性腦缺血后，早期免疫系統迅速啟動，免疫細胞激活，參與炎癥反應。白細胞是人體最主要的免疫細胞，腫 瘤 壞 死 因 子 -α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β， IL-1β)是缺血再灌注損傷后較早表達的炎癥細胞因子。腦缺血再灌注急性期白細胞被 IL-1β、TNF-α等炎性因子激活，之后在細胞黏附分子作用下黏附于缺血區微血管內皮細胞上，阻塞微血管，使再灌注血流減少;并且隨著再灌注的發生，在趨化因子白介素-8(IL-8)的作用下，白細胞進入缺血區，釋放促炎因子，加重炎癥反應。可見，減少白細胞浸潤，抑制 IL-8、IL-1β、TNF-α等因子的產生和釋放對腦組織損傷能夠起到保護作用[9]。電針預處理能夠下調腦缺血再灌注大鼠血漿中的 IL-6、IL-1β及 TNF-α含量，從上游阻斷炎癥反應的惡性循環，減輕神經功能損傷，實現腦保護作用[11]。同時，電針預處理還可能通過調控嘌呤受體P2Y1R、P2X7R的表達，減少炎性因子TNF-α、IL-β含量，誘導腦缺血耐受[12]。

1.2 小膠質細胞及相關細胞因子

在中樞神經系統中，小膠質細胞發揮著類巨噬細胞的作用，是最先針對損傷產生應答的細胞，是中樞神經系統第一道免疫防線。活化的小膠質細胞分為經典激活狀態(M1型)和選擇性激活狀態(M2型)兩種表型[13]。前者受 Toll樣受體 4(toll-like receptor4，TLR-4)和干擾素-γ (interferon-γ， IFN-γ)激活，可增加促炎因子的產生，加重炎癥反應和組織損傷程度。后者主要由白介素-4(IL-4)或白介素-13(IL-13)誘導，通過發揮巨噬細胞的作用達到抑制過度炎癥反應和修復組織損傷的效果。腦缺血損傷發生后，小膠質細胞聚集在病灶周邊，發揮雙重調節作用。一方面，小膠質細胞不停地吞噬及清除病原體、細胞碎片等毒性物質充分發揮抗神經損傷作用[14]。與此同時，小膠質細胞過度活化產生多種過量的炎性介質，加重神經損害過程[15]。電針預處理可減少 MCAO大鼠腦內 TRL4、NF-κB蛋白表達，抑制小膠質細胞 TRL4/NF-κB信號通路的活性，減輕炎性反應，減輕MCAO大鼠神經損傷[16]。電針預處理能夠調控小膠質細胞活化狀態，在腦缺血再灌注損傷修復期，誘導小膠質細胞由M1型向M2型轉化，進而發揮抗炎作用，達到腦保護的目的[17]。

2 抑制興奮性氨基酸毒性

興奮性氨基酸的興奮性毒性被認為是腦缺血損傷級聯反應誘發的初始因素[18]。廣泛分布于神經系統的谷氨酸是中樞神經系統內主要的興奮性氨基酸神經遞質，正常狀態下，谷氨酸由突觸前膜釋放到突觸間隙，作用于突觸后膜上的受體，以完成一系列生理性活動。在突觸間隙中，谷氨酸的清除(再攝取)主要依賴谷氨酸轉運體(glutamate transporter-1， GLT-1)[19]。腦缺血狀態下谷氨酸轉運體功能紊亂，谷氨酸過度蓄積并刺激谷氨酸受體過度興奮，進而過度刺激神經元，誘發神經元興奮性損傷[20]。因此，腦缺血后，減輕氨基酸興奮性損傷可以從其轉運體及受體兩方面考慮。

2.1 調節谷氨酸受體

突觸(細胞)膜上谷氨酸受體主要有代謝型受體(metabotropic glutamate recrptors， mGluRs)和離子型受體 N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor， NMDA)受體與α-氨基-3-羥基-5-甲基-異惡唑丙酸 (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid recrptor， AMPA)受體[21]。NMDA受體主要由NR1、NR2、NR3 3種亞基組成。當NMDA受體被Glu激活后，會使細胞膜的通透性增加，主要是增加細胞內的鈣離子(Ca2+)水平，從而加劇Glu興奮性毒性作用。AMPA的亞基受體GluR2可以限制細胞膜對Ca2+及其他陽離子的通透作用。腦缺血再灌注后，GluR2減少，形成以GluR1或GluR3為主、GluR2缺乏的新受體，使細胞內Ca2+水平增加，加重腦損傷[22]。研究顯示，電針能抑制大鼠缺血腦組織 mGluRs的表達，緩解腦損傷[23]。電針預處理可使缺血腦區NR1的表達水平顯著降低，發揮神經保護作用[24]。同時，電針預處理也通過調節大麻素受體1(cannabinoid receptor 1，CB1R)提高GluR2表達水平，以抑制突觸后膜對Ca2+的通透作用，減輕興奮性毒性，改善神經功能[25]。

2.2 調節谷氨酸轉運體

谷氨酸再攝取最主要細胞類型是星型膠質細胞[26]。在大鼠星型膠質細胞內表達的主要谷氨酸轉運體是 GLT-1，其對應的人類同源體是興奮性氨基酸轉運 體 2(excitatory amino acid transporter 2，EAAT2)。有研究顯示，電針可以提高腦內谷氨酸轉運體GLT-1的表達和活性[27]，也可使缺血半暗帶的EAAT2下調水平被抑制[28]，缺血區細胞外谷氨酸濃度下降[29]，以減輕腦缺血后神經細胞損傷，誘導腦缺血耐受。

3 減少細胞凋亡與自噬

機體內細胞程序性死亡的兩種主要形式是細胞凋亡和細胞自噬。細胞凋亡是一種主動過程，涉及到一系列基因的激活、表達以及調控等程序。細胞自噬是細胞自身溶酶體降解細胞內自身物質，尤其是長壽蛋白和受損細胞器的過程。生理情況下，細胞凋亡和細胞自噬共同維持細胞內環境穩態。

3.1 減少神經細胞凋亡

缺血性腦損傷與神經細胞凋亡關系密切。腦缺血后，由于急驟缺血缺氧，缺血中心區的神經細胞發生不可逆的損傷，迅速死亡。而在缺血半暗帶區，神經細胞損傷具有可逆性，若損傷未能得到及時修復，則會導致缺血半暗帶的神經細胞凋亡。因此抑制腦缺血后神經細胞凋亡的發生，是發揮腦神經保護機制的關鍵環節。細胞凋亡是由特定的基因和蛋白調控的[30]。其中細胞凋亡蛋白酶(caspase)家族中的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)是缺血半暗帶區介導細胞凋亡至關重要的蛋白酶[31]。組織缺氧等應激變化，可誘導p53蛋白激活，而被激活的p53蛋白能夠調節細胞周期，調控細胞分化和促進細胞凋亡[32]。另外，抗凋亡基因(Bcl-2)與促凋亡基因(Bax)亦相互作用來影響腦缺血再灌注損傷的細胞凋亡[33]。研究顯示，電針預處理能夠抑制腦缺血后缺血半暗帶皮質區域caspase-3、p53及Bax表達上調，促進Bcl-2表達上調減少缺血后細胞凋亡[34]。

3.2 調節細胞自噬

腦缺血后，細胞自噬在缺血腦組織內發揮“雙刃劍”作用。一方面自噬適度激活可保護神經細胞，發揮腦保護作用。另一方面，過度激活自噬可導致自噬細胞的裂解、死亡。另外自噬不足，受損的細胞器和蛋白不能及時被清除，也會影響細胞的功能，加重腦損傷[35]。已有研究證實電針可通過調節自噬相關蛋白 LC3A/B適度激活自噬，進而改善神經功能[36]。電針預處理能夠抑制AMPK-Beclin1/Vps34通路以減少自噬激活[37]。

4 抗氧化應激

氧化應激因體內的活性氧、氧自由基增加，以及抗氧化應激防御系統的減少而發生。氧化應激能夠激活細胞內的凋亡信號通路，導致細胞死亡。線粒體是細胞的“能量工廠”，參與氧化應激反應。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)是一種抗氧化劑，可清除體內氧自由基，丙二醛(malondialdehyde， MDA)是自由基作用于脂質發生過氧化反應的最終產物，兩者是反應氧化應激程度的重要指標。腦缺血再灌注后缺血組織會產生大量活性氧和自由基，引發線粒體功能障礙，導致腦組織內氧化與抗氧化系統失衡，造成腦損傷。有研究顯示，電針預處理可減輕MCAO大鼠腦組織中線粒體結構損傷，同時上調 SOD水平，下調 MDA水平[38]，實現對缺血組織神經元的保護作用。

5 維持血腦屏障完整性

血腦屏障(blood-brain barrier， BBB)由連接緊密的毛細血管內皮細胞、完整的基底膜以及星形膠質細胞終足共同組成的神經膠質膜結構[39]，作為一種彌散屏障用于維持中樞系統功能。腦缺血后，BBB完整性被破壞，導致腦水腫，引起神經細胞的損傷及凋亡[40]。基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)是基質金屬蛋白酶家族中與腦微血管疾病關系最為密切的酶[41]，在缺血后血腦屏障損傷和血管源性腦水腫的發生中起關鍵作用[42]。電針預處理后，MCAO大鼠缺血腦組織中 MMP-9的表達及活性明顯降低[43]，腦水腫癥狀減輕[44]，可見，電針預處理能夠通過降低MMP-9的表達以維持血腦屏障完整性。

6 討論

綜上所述，電針預處理能夠調節白細胞和小膠質細胞及相關細胞因子以減輕神經元的炎性反應，并通過抑制興奮性氨基酸毒性來減少神經元變性;電針預處理還通過平衡腦組織內氧化與抗氧化系統、調控神經細胞凋亡和自噬相關蛋白及通路，從而降低神經元的大面積死亡程度;電針預處理通過維持血腦屏障完整性，以及抑制再灌注后血管源性腦水腫的發生和出血性轉化來實現缺血性卒中的腦保護效應，電針預處理具有顯著的誘導腦缺血耐受效應[5，10，14，29，38]。電針預處理誘導腦缺血耐受的過程，是通過調控機體內多種途徑的各類分子、不同細胞、相關蛋白，進而調節腦血流、腦代謝、神經血管活動得以實現的，電針預處理是具有多水平、多靶點、多途徑特色的一種干預手段。

當前的實驗研究多選擇 MCAO大鼠缺血側腦組織進行研究，對于健側腦相關區域的研究較少。缺血性腦損傷患者不僅存在病灶本身的變化，也存在一系列繼發性改變，包括缺血半暗帶區域以及健側大腦半球。有研究報道，腦缺血急性期時健側大腦半球激發者預后更佳[45]，且鍛煉健側的康復方法在臨床上也較有成效[46]。在今后的研究中，可以考慮以健側為目的區域，科學全面地觀察電針預處理對腦缺血耐受作用。現有關電針誘導腦缺血耐受的研究，實驗方案不統一，針刺方法種類多樣、穴位選擇標準不一、干預時機未能明確。在未來的研究中，進一步優化實驗方案，確定針對性的針刺方法(如不同年齡的MCAO大鼠采用不同的針刺方式)，選擇循證醫學支持下較為統一的穴位配伍方式(如五腧穴、經穴、阿是穴)，明確干預周期及干預時間，以期獲得更大、更穩定的研究價值。目前對于電針預處理誘導腦缺血耐受的機制研究中，在實驗的時效方面，未能及時監測干預時相關腦區的即時活動狀態，即電生理技術的使用尚欠充分。近年來，功能性磁共振成像作為一種對機體無損的技術，已被廣泛應用于視覺、思維、情感、認知等方面的研究[47]。小動物磁共振的使用日益廣泛，光遺傳技術的應用和成熟也為電針預處理卒中研究帶來了新的技術方案。在今后的實驗中，可以考慮利用先進技術進行針灸腦科學領域的應用與研究，以明確腦功能區對電針預處理的反應，即時觀察針刺的神經機制，從而促進針灸與現代醫學融合。另外，目前電針預處理誘導腦缺血耐受的方式在臨床上應用范圍較局限，之后可嘗試單獨或配合其他預處理方式對冠心病、高血壓等具有卒中危險因素的對象進行臨床干預，以擴大電針預處理的臨床適用范圍。