細胞周期蛋白依賴性激酶9及其抑制劑在腫瘤治療中的研究進展

王向遠，郭青龍，惠慧

（江蘇省南京市鼓樓區童家巷24號中國藥科大學玄武門校區，江蘇省腫瘤發生與干預重點實驗室，江蘇 南京）

0 引言

細胞周期的進展受嚴密調控因子的復雜網絡控制，其中關鍵是細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶（Cdk / Cdc）[1]。細胞周期控制機制的崩潰是癌癥的重要特征之一，而靶向細胞周期調控是癌癥治療中反復出現的主題[2]。與化學療法相比，靶向療法具有最大化療效和降低毒性的優勢[3,4]。臨床前研究已經確定了幾個潛在的靶標，而CDK9是最近引起人們越來越多興趣的藥物靶標之一。抑制CDK9能夠選擇性地降低許多癌癥中上調的蛋白質，從而引起細胞增殖抑制和凋亡[5]。CDK9抑制劑單獨使用以及與常規化療（例如抗代謝物或微管抑制劑）聯用的方案都進入了臨床研究階段[6]。

1 CDK9的發展簡述

細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）家族由以下成員組成，這些成員是細胞分裂周期的關鍵調控因子（細胞周期CDK），參與基因轉錄的調控蛋白（轉錄CDK）以及具有其他功能的CDK，例如CDK5參與正常的神經元遷移和分化，軸突伸長和突觸[7]。細胞分裂周期的正確時機和順序需要細胞周期CDK 1、2、3、4和6，而轉錄CDK7和CDK9通過羧基末端結構域（C-terminal domain，CTD）的磷酸化來調節RNA聚合酶II的活性[8]。它在RNA轉錄和延伸、細胞分化的調控以及其它細胞生物學過程中發揮重要作用。最近研究表明，CDK9 與艾滋病、心肌細胞肥大、血管生成、炎癥等疾病的發病過程有關，且CDK9在多種腫瘤的發展過程中起著至關重要的作用[9,10]。

1994年，CDK9首次被發現，因為它具有Pro-Ile-Thr-Ala-Leu-Arg-Glu特征性而被命名為PITALRE[11]。PITALRE被確定為正轉錄延伸因子b（positive transcription elongation factor b，P-TEFb）的催化亞基，P-TEFb是一種蛋白激酶復合物，可在體外過度磷酸化RNA聚合酶II大亞基的CTD。有人將P-TEFb描述為新的CDK/細胞周期蛋白對，首次將其亞基命名為CDK9和Cyclin T。此后，鑒定出了Cyclin T1、T2a、T2b和K[12]。CDK9與Cyclin T1，T2a，T2b和K形成異源二聚體復合物。Cyclin T2a和T2b是同一個基因的兩種mRNA剪接產物，在其C端具有67個氨基酸[13]。CDK9在其所有組織中均普遍表達，其激活劑Cyclin T1、T2a和T2b細胞周期蛋白也如此[14]。而Cyclin K主要在睪丸，胃和骨髓中表達[15,16]。

自CDK9被發現以來，一直被人們認為是分子量約42 kDa的蛋白質。然而2003年，研究人員鑒定出了一種新的同工型，該同工型是從同一基因的替代啟動子轉錄而來，比原始啟動子重13 kDa。自此CDK9同工型開始被命名為CDK942和CDK955[17]。研究表明，這兩種亞型均存在于HeLa，NIH/3T3人類巨噬細胞和小鼠肺和肝組織，但豐度不同。相關研究結果表明CDK942和CDK955同工型的表達受到差異調節，并且這兩種同工型之間的功能差異可能取決于其亞細胞定位、表達模式以及對底物獲取方式的不同。且CDK942和CDK955啟動子具有不同的活性和對激活信號的響應[18]。相關研究發現，CDK942在RNA轉錄和延伸、細胞分化調控等細胞生物學過程中發揮重要作用。而CDK955能與參與DNA修復的蛋白質Ku70特異性結合，但CDK942與這種作用不相關，表明CDK955可能在DNA的修復中起作用[19]。這些結果表明，盡管尚未在文獻中對其進行具體表征，但應區分這兩種同工型的功能。

2 CDK9的作用機制

CDK9不是典型的Cdc2樣激酶，不參與細胞周期調控過程。相反，它在轉錄過程中起作用。CDK9是轉錄CDKs亞家族的重要成員，該家族是一組激酶，其功能是控制真核RNA聚合酶II合成和加工mRNA的主要步驟[20]。作為細胞周期蛋白依賴性激酶，體內CDK9激活取決于其與Cyclin T的結合，以組裝P-TEFb。雖然有其他能夠使CTD磷酸化的細胞周期蛋白依賴性激酶，但是唯一以催化劑方式激活基因表達的激酶是CDK9。因此，Cyclin T /CDK9是一種在轉錄中起作用的專用激酶，而在體內CTD是該復合物的主要功能靶點[21]。盡管CDK9的基本機制很復雜并且尚未完全闡明。

RNA聚合酶II負責真核生物中蛋白質編碼基因的轉錄，與所有其他RNA聚合酶的不同之處在于，其最大的亞基包含一個CTD，該域由七肽重復序列和YSPTSPS共有序列組成[22,23]。CTD的磷酸化與轉錄循環中的各個步驟相關。次磷酸化的RNA聚合酶II被募集到轉錄起始位點，并形成預起始復合物。

CTD的磷酸化位點數量超過50個，絲氨酸是其主要的磷酸化位點[24]。而由CDKs對CTD進行磷酸化的主要有2種：一種是CDK7磷酸化的Ser5（YSPTSer5PS）[25,26]，另一種是CDK9磷酸化的Ser2（YSer2PTSPS）[27]。首先，CDK7磷酸化Ser5，從而激活RNA聚合酶II，Ser5磷酸化的RNA聚合酶II能夠刺激RNA的轉錄，但不是其延伸過程[28,29]。P-TEFb對Ser2的磷酸化作用促使RNA轉錄的延伸。因此，P-TEFb對在細胞中產生成熟的mRNA是必不可少的。

CDK9的活性取決于與Cyclin T的結合，并通過與其他大分子的結合而進一步受到調節。這些調節劑包括激活劑，例如c-myc，NF-κB，雄激素受體，Brd4 或超伸長復合物的亞基和抑制蛋白復合物，例如含有復合物的抑制性7SK小核RNA（7SK snRNA）[30-33]。CDK9的激酶活性失調與多種人類病理狀況有關，例如過度增生性疾病（例如癌癥），以及病毒引起的傳染病和心血管疾病。PTEFb介導的短壽命抗凋亡生存蛋白的轉錄，Mcl-1等癌基因和c-MYC等癌基因在癌細胞的生長和存活中起著至關重要的作用。另外，這些蛋白質在對化學療法的抗性發展中顯示出重要的功能。抑制CDK9會導致這些重要的生存蛋白和癌基因的短壽mRNA轉錄本迅速耗盡。因此，選擇性暫時抑制排他性轉錄調節CDK9是癌癥治療中一種有希望的新方法[7]。

3 CDK9抑制劑的研究進展

對小分子的研究是發現靶向癌癥治療成功藥物的基礎。CDK9是許多癌癥的轉錄調節因子和潛在治療靶標。多種非選擇性CDK9抑制劑已在臨床上取得進展。本文中，我們總結了一些被設計為具有CDK9抑制作用的抗腫瘤藥物的小分子以及相關臨床研究的進展。

3.1 非選擇性CDK9抑制劑

3.1.1 Flavopiridol

Flavopiridol是一類天然黃酮類化合物，它是第1個被發現的CDK9抑制劑，也是最先進入臨床研究的CDK9抑制劑。Flavopiridol抑制CDKs，CDKs控制細胞周期進程并磷酸化RNA聚合酶II的CTD[11]。其對CDK9抑制的效力最好，在復發性或難治性慢性淋巴細胞性白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）患者中有很好的療效，其抗腫瘤活性似乎是CDK9介導的抗凋亡蛋白轉錄的下調，目前已經是美國FDA指定用于CLL治療的孤兒藥。然而，Flavopiridol在Ⅰ，Ⅱ期臨床試驗中出現了很多不良反應，如血小板減少、血栓、嗜中性白血球減少、疲乏等[34,35]。上述嚴重毒性的高發生率阻礙了其作為療法的臨床發展。

3.1.2 Dinaciclib

Dinaciclib是目前最先進的CDK9抑制劑，是一種有效的選擇性CDK抑制劑，抑制CDK2，CDK5，CDK1和CDK9的IC50分別為1，1，3和4nM[36]。目前處于針對CLL作為單一藥物的III期臨床試驗和針對不同血液惡性腫瘤以及某些實體瘤的II期臨床試驗中[37]。然而，其藥代動力學性能差，缺乏對CDK9的長時間抑制作用[38,39]。在三項涉及該藥的II期研究中，對治療沒有完全反應，并且75-95%的患者遭受了不良反應[2]。據報道其有幾種免疫相關的不良反應，如中性粒細胞減少和白細胞減少。同 flavopiridol一樣，它也被賦予了CLL的孤兒藥地位。

3.1.3 SNS-032

SNS-032是CDK2，7和9的有效和選擇性抑制劑，IC50 值分別為48，62 和4 nM。SNS-032對CDK1和CDK4的敏感性較低，IC50分別為480 nM和925 nM。與Flavopiridol相比，SNS-032在抑制RNA合成和誘導細胞凋亡方面更有效，SNS-032的活性易于逆轉。在分子水平上，SNS-032誘導RNA聚合酶II的ser2和ser5去磷酸化，并抑制CDK2和CDK9以及去磷酸化CDK7的表達[40]。無論預后指標和治療史如何，SNS-032均可在體外有效殺死CLL細胞。研究表明，SNS-032在白血病和實體瘤中具有抗腫瘤活性[41,42]。對轉移性難治性實體瘤患者進行的I期臨床試驗研究表明，SNS-032具有良好的耐受性，對于口服給藥可能是可行的[43]。在I期臨床試驗中，SNS-032在晚期CLL和多發性骨髓瘤患者中表現出適度的臨床活動[44]。但是和其他的非選擇性CDK9抑制劑一樣，SNS-032的不良反應發生率高且較為嚴重[45]。

3.1.4 Seliciclib

Seliciclib已被證明是多種CDK的有效抑制劑，其對CDK1，CDK2，CDK5，CDK7，CDK9的IC50 值分 別 為0.65μM，0.7μM，0.2μM，0.49μM和0.79μM。Seliciclib對CDK4，CDK6和 其 他80多種其他激酶均不敏感或僅被弱抑制[46]。在腫瘤細胞中，Seliciclib誘導細胞凋亡，同時下調抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員Mcl-1[47,48]。Seliciclib已在許多I期和II期臨床試驗中進行了測試，該藥物已用于治療約450名癌癥患者，并這些患者中顯示出約一半的抗癌活性。Seliciclib還已經在I期試驗中與吉西他濱和順鉑聯用在非小細胞肺癌患者中進行了測試。Seliciclib還正在與晚期核實體瘤患者一起用核苷類似物Sapacitabine（CYC682）聯合治療進行臨床測試，并與EGFR抑制劑Erlotininb（Tarceva）聯合用于晚期實體瘤標志物[49,50]。

3.2 選擇性CDK9抑制劑

3.2.1 AZD4573

AZD4573是一種新型的，高效且高選擇性的CDK9抑制劑。其抗腫瘤活性在體外廣泛的癌細胞系以及體內細胞系和患者來源的異種移植模型中得到了確定。它被證明在體外血液癌癥模型中廣泛地快速誘導細胞凋亡和隨后的細胞死亡，并且以劑量和時間依賴性的方式消耗Mcl-1，這是AZD4573誘導腫瘤細胞死亡的主要機制。目前正在I期臨床試驗中對患有血液系統惡性腫瘤的患者進行AZD4573的評估[51]。

3.2.2 atuveciclib

atuveciclib是第一種進入臨床試驗的有效且高度選擇性的PTEFb / CDK9抑制劑。該化合物在體外顯示出強大的PTEFb抑制活性和高激酶選擇性。 atuveciclib在小鼠和大鼠的急性髓樣白血病的人類異種移植腫瘤模型中均有效。該化合物在每日一次給藥以及間歇給藥方案后均具有活性，為優化人類給藥方案的有效性和耐受性提供了寶貴的選擇[52]。

3.2.3 CDKI-73

CDKI-73是CDK9的高效小分子抑制劑。它顯示出對來自不同來源的多種癌細胞系的有效細胞毒性作用，但已證明對正常細胞的毒性較小。CDKI-73誘導caspase依賴性細胞凋亡，其后是CDK9和RNA聚合酶II ser2位點脫磷酸化。與正常的CD34+細胞相比，CDKI-73比泛CDK抑制劑Flavopiridol更有效，并且對原發性白血病細胞的選擇性超過200倍[53]。CDKI-73還通過與多種抗凋亡蛋白（例如Mcl-1，Bcl-2和XIAP）轉錄抑制相關的機制顯示了與氟達拉濱的協同作用，這為治療CLL和氟達拉濱復發疾病提供了有前景的治療策略。此外，最近，Lam等人對A2780卵巢癌細胞的敲低研究表明，CDK9的下調通過Mnk-eIF4E軸影響了致癌翻譯[54]。

4 結語

CDK9是癌癥治療中不斷發展的目標。CDK9抑制劑在體外已顯示出良好的抗腫瘤活性。CDK9抑制劑也在臨床前模型中顯示出了廣闊的前景，目前已經有有許多CDK9抑制劑被開發出來，其在單藥以及與其他抗癌藥聯用中臨床試驗顯示出較好的治療效果。但是由于大多數CDK9抑制劑對其他CDKs和酶缺乏選擇性，因而在臨床試驗中治療窗口狹窄，并具有嚴重的并發癥以及明顯的副作用。因此，可以預想高選擇性CDK9抑制劑的研發將為腫瘤提供極具潛力的療法。