重癥侵襲性肺曲霉病的診斷新進展

0 引言

侵襲性肺曲霉病（Invasive pulmonary aspergillosis,IPA）是一種真菌病，通常由煙曲霉菌引起，煙曲霉是一種腐生和普遍存在空氣傳播的真菌，其病的發生不僅取決于曲霉菌的數量和毒力，還取決于宿主的免疫狀態和肺部的基礎疾病[1]，重癥侵襲性肺曲霉病（Severe Invasive Pulmonary Aspergillosis, SIPA）亦是如此。2017年全球估計表明，每年約有25萬例患者發生曲霉病（Aspergillosis，IA）[2]，且IA與高死亡率相關，那些在體內得到診斷的患者中，死亡率從30%到50%不等[3]。此外，從醫院死亡中進行常規尸檢的機構表明，大約50%的IA患者僅在死后才被發現[4]。重要的是，早期開始適當的抗真菌治療可以顯著改善IA的結果[5]。可見早期診斷可明顯改善患者預后。現就對SIPA的診斷新進展作一綜述。

1 影像學

胸部CT掃描是診斷SIPA的首選成像方式。IPA的放射學類型主要包括4種侵襲方式[6]：血管侵襲型、氣道侵襲型、混合侵襲、未定型侵襲，血管侵襲的影像學包括暈輪征、梗死狀結節、內部低衰減、空洞、新月征、大結節；氣道侵襲型的影像學包括小氣道病變、支氣管周圍實變、支氣管擴張或壁增厚；混合侵襲的影像學符合血管侵襲和氣道侵襲；未定型侵襲的影像學不滿足上述任何一種情況。典型地，在中性粒細胞減少的患者中，IPA表現為周圍有磨玻璃浸潤的肺結節(稱為“暈輪征”)，這些結節可能會空化并產生“空氣新月征”。盡管是IPA在影像學上的典型征象，但“暈輪征”和“空氣新月征”均出現在不到10%的中性粒細胞減少患者[7，8]，很少出現在非中性粒細胞減少患者[7]，而其他典型的IPA放射學征象僅出現在約30%的非中性粒細胞減少患者[8]。在潛在的血液系統惡性腫瘤患者中，CT肺血管造影(CTPA)通過顯示血管閉塞征象，比傳統的胸部CT成像更敏感和特異地診斷血管侵襲性IPA，但與傳統CT相比對IPA的其他征象(暈征，反暈征)的表現尚不清楚[9-11]。將CT和正電子發射斷層掃描(PET)與([18F]FDG)結合，([18F]FDG)通常用于癌癥分期以評估新陳代謝活動，但在IPA中的用途有限，因為它不能區分感染病因、癌癥和其他引起炎癥的原因[12-13]。一種有趣的診斷IPA的新方法是抗體引導PET/磁共振成像(免疫PET/MRI)。將[64Cu]DOTA標記的單克隆抗體mJF5應用于感染煙曲霉的中性粒細胞減少癥小鼠，結合PET掃描可以定位感染的肺組織，并且能夠區分曲霉和細菌病原體，也可以區分曲霉誘導的炎癥和無菌性炎癥。用另一種單克隆抗體成像，該單克隆抗體的熒光團(DyLight650)標記的版本顯示侵襲性菌絲的定位。[64Cu]DOTA標記的單克隆抗體mJF5的另一個優點是其長半衰期，這可能允許通過系列成像監測對抗真菌治療的反應[14]。雖然臨床前小鼠模型顯示這種新模式的潛力，但目前尚不清楚免疫PET/MRI在免疫功能正常患者、肺外IA患者、壞死組織患者中效果如何。因此，未來對免疫PET/MRI研究是有必要的。

2 組織病理學檢查

曲霉只在部分的支氣管肺泡灌洗液(BALF)和痰中生長，因此，IPA的確診仍需要病理活檢。IPA的感染通常表現為出血、壞死、膿腫或肉芽腫形成等，病灶邊緣可有小動脈栓塞，組織內見菌絲及孢子可明確診斷[15]。但病理學檢查往往存在時間方面的滯后性，也對病變發生的部位和人群具有選擇性。例如在嚴重急性呼吸衰竭、肺水腫、出血、感染以及血小板減少患者上就很難實施[16]。

3 病原學檢查

傳統的真菌病原學檢查依然是SIPA診斷的基礎和線索。直接顯微鏡可觀察菌絲的形態，發現曲霉屬窄，有隔膜，透明，45度銳角的菌絲分枝，分生孢子呈鏈狀、分離或分散出現。當分生孢子是單個或成對時，它們可能類似于酵母細胞，在顯微鏡下，曲霉可能與其他幾種絲狀真菌混淆，包括鞘孢菌屬和鐮刀菌，因此需要通過培=養對病原體進行明確的鑒定。煙曲霉菌在24-48小時內開始在真菌培養基和綿羊血瓊脂上發育，菌落呈天鵝絨狀，灰藍色-綠色菌落。雖然顯微鏡和培養是診斷SIPA的基石，但很多SIPA患者的培養結果都是陰性的。因此需要結合其他方法和臨床大夫的經驗，使得在個體中更好的診斷。

4 抗原標志物的檢測

4.1 真 菌 葡 聚 糖(1-3-β-D葡 聚 糖，beta-glucuronidase，BDG)

真菌葡聚糖(1-3-β-D葡聚糖，beta-glucuronidase，BDG)是包括曲霉在內的大多數致病真菌的細胞壁成分,可作為IA的非特異性標記物。雖然BDG在辨別真菌病原種類上存在缺陷，但國際上已經將BDG納入血液惡性腫瘤患者發生IPA臨床診斷的微生物學標準之一，其診斷價值得到肯定。但在BALF-G試驗診斷實體器官移植中侵襲性真菌感染的一項前瞻性多中心研究中[17]，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為79.2%、38.5%、27.6%和86.3%，在血清中G試驗的分別為79.2%、81.8%、69.2%和83.1%。因此，G試驗的準確性值得商榷的，其作為早期診斷IPA在肺移植人群中的應用值得懷疑。然而，最近一項研究報道，對于小兒造血干細胞移植后IPA的診斷中，聯合進行胸部CT檢查和BDG檢測其敏感性和特異性都高于單獨應用一種檢測方法[18]。由于BDG測定沒有特異性，在發生侵襲性肺曲霉病的高危人群是否采用抗真菌治療的判定中可起到提示作用。

4.2 半乳甘露聚糖實驗(galactomannan，GM)

半乳甘露聚糖實驗(galactomannan，GM)是曲霉細胞壁的多糖成分，通過菌絲生長和孢子/分生孢子萌發釋放[19]。對于IPA患者，外周血（血清和血漿）、BALF、尿液、腦脊液或胸水中可檢測到GM[20-22]。重要的是，血GM主要在中性粒細胞減少的患者作為診斷IA的標志物，這些患者表現為曲霉屬的血管侵襲性生長，而氣道侵襲性生長是非中性粒細胞減少患者的典型模式。這排除了大多數非中性粒細胞減少型IPA患者的血GM陽性[23-25]，BALF GM檢測已經成為診斷IPA的標準。在非中性粒細胞減少和中性粒細胞減少患者中表現同樣好，盡管與所有其他IA診斷測試一樣，敏感性可能在有曲霉活性預防的情況下被降低[26-28]。因此有效的抗真菌治療已經被證明可以降低GM水平，血清GM也被認為是IPA治療分層和預后預測的一個有前途的指標[29,30]。雖然GM仍然是診斷IA最重要的檢測手段，但它有著重要的局限性。由于可能出現假陽性結果，必須考慮聯合用藥，基礎疾病，影像學表現，臨床癥狀等因素，以正確解釋GM水平。最后，結果變化因時間設置的不同而不同，這也可能導致診斷延遲[31]。

5 分子檢測

從90 年代開始，各類聚合酶鏈反應技術就被廣泛運用于檢測血液中真菌脫氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid，DNA)。核酸檢測(nucleic acid detection，NAT)的應用不僅可以提高診斷速度，其中一些測試可以在幾個小時內完成，并具有高敏感性和特異性[32,34]。然而，缺點包括試劑和設備的高成本，人員有素的訓練，實驗室的高標準要求，樣品或試劑的污染[32,33,35,36]。一些研究結果顯示PCR檢測劣于血清GM試驗，但也有一些研究結論正好相反。近年的幾項研究認為，在接受抗真菌治療的情況下，改良的PCR法比GM試驗更敏感，最近一項研究表明兩種方法聯合檢測診斷IPA的敏感性和特異性分別為97%、97.5%，在提高敏感性的同時仍具有高的特異性[37]。但當前處理標本的技術對提高真菌檢測敏感度的效果尚未明確，不同PCR技術對于真菌檢測結果也不盡相同[38,39]。并且缺乏標準化的PCR操作技術，導致各類研究結果存在顯著性差異。

6 LFD技術

2008年，Thornton[40]利用煙曲霉的凍干菌絲免疫小鼠，制備了一株單克隆抗體MAb JF5，它與煙曲霉菌活躍生長過程中分泌的胞外糖蛋白抗原上的蛋白表位結合，MAb用于開發免疫層析側流裝置（LFD），用于快速檢測人血清中的曲霉抗原。該試驗具有高度的特異性，可與曲霉屬種的抗原發生反應，但與包括念珠菌在內其他真菌的抗原不會發生反應，因此，LFD的易用性為具有較高IA風險的患者提供了一個診斷平臺，但目前的研究還未經大量臨床樣本驗證，因此，LFD在臨床上應用的推廣還需進一步的探討。

7 質譜分析法

真菌在感染宿主細胞的過程中會產生真菌毒素，其中最具有殺傷力的是一種被稱為真菌鐵載體的蛋白。基質輔助-激光解吸電離質譜分析法可以檢測血液、肺組織和尿液中此種蛋白的含量，特別是在組織標本中檢測這種由真菌代謝產生的物質，可減少由直接鏡檢得出的假陽性結果[41]。這種檢測方法具有好的應用前景，但目前尚未在人群研究中的證實。

綜上所述，IPA的及時診斷仍然是一大挑戰。近年來，由于IPA的發病率和死亡率持續增高，因此，研究快速、精準的診斷方法勢在必行。傳統的組織病理學、病原學培養目前逐漸被新型分子診斷方法所替代。最近研究發現，曲霉菌素，一種具有免疫調節性質的曲霉次級代謝產物，能夠在IPA患者的血清中檢測到，導致某些細胞因子升高，特別是IL-8的水平升高，在IPA患者的血液和BALF中可檢測到[42]。最近，高血清IL-8水平（＞300pg/mL）已顯示出對IA具有高度特異性，此外，當與BALF LFD或BALF曲霉PCR結合使用時，血清IL-8對IPA也具有高度特異性。目前正在進行較大的多中心研究以驗證這些發現。如果想提高診斷的敏感性及特異性，還需要更多的臨床試驗及探索。