富血小板血漿在組織工程研究中的應用現狀

段江濤，朱倫井，彭稱飛，王寧，陳俊毅，貝朝涌

（桂林醫學院附屬醫院四肢創傷骨科，廣西 桂林）

0 引言

富血小板血漿（PRP）是血液濃縮產物，含有大量血小板，可通過離心或血液分離技術得到。

全血離心后，可以明顯區分紅細胞層和血漿層。在中間可以找到含有大部分白細胞和血小板的血沉棕黃層，再將其用于制備PRP。在某些方案中，對血沉棕黃層/血漿層再次離心可獲得更純化濃縮的PRP[1]。

傳統上將PRP定義為含濃度至少200-1，000×103/μL血小板的血漿[2]。根據PRP的激活方法分為內源性和外源性激活[3]。多使用凝血酶和/或氯化鈣激活PRP[4]，激活后形成水凝膠，其可持續分泌生長因子[5]，并可運載細胞[5-6]。

血小板可釋放轉化生長因子β（TGF-β），成纖維細胞生長因子2，血小板衍生生長因子的亞型（PDGF-AA，PDGF-AB，PDGFBB），胰島素樣生長因子-1，表皮生長因子和肝細胞生長因子[7]。Jalowiec等[5]的研究表明，凝血酶活化形成的血小板凝膠中血小板濃度與蛋白質的分泌之間呈正相關，并且在凝膠化后最初的4小時內觀察到生長因子釋放峰值。在不同血小板濃度下均發現TGF-β1的高水平釋放，其次是PDGF-AB和PDGF-BB。此外，他們發現PRP凝膠還釋放了炎癥介質，釋放最多的是趨化因子CCL5。與此對應，El-Sharkawy等[8]報道了PRP中生長因子的高水平。此外，他們還發現了脂質介體脂蛋白A4含量增加，已知其與炎癥消除有關。因此，PRP可釋放細胞因子并可抑制炎癥反應。

PRP存在生物學差異，不同的制備方法會加劇這種差異[9]。kushida等[10]報道了七種商業制備系統制備的活化PRP中生長因子濃度的巨大差異。Mazzocca等[11]從8位健康受試者身上抽取血液，除了一步離心法和兩步離心法在血小板濃度方面的差異外，他們還強調了不管如何選取分離方法，血小板計數和生長因子濃度存在著顯著個體差異。

盡管PRP暫時達不到統一的標準化制備，其已被廣泛地應用于臨床。PRP的應用旨在基于其含有的豐富生長因子，通過各種未盡知的機制來促進組織再生。Hsu等[12]回顧了骨水泥中加入PRP在肌肉骨骼再生中的應用，并指出了多種因素對治療成功與否的影響。

根據白細胞含量多寡可以分為貧白細胞和富白細胞PRP。應根據應用部位來選擇PRP中白細胞的濃度。例如，貧白細胞PRP適用于關節腔內注射[13,14]。除骨科和運動醫學外，醫學其他領域也已有PRP的多種治療應用。

1 組織工程中的PRP

骨、軟骨、皮膚和軟組織修復，各種組織工程研究中均有PRP的應用。除將PRP當作生長因子來源外，更多的作為生長因子和/或細胞的遞送體與生物材料相結合來構建工程復合體。在這些研究中，PRP的制備以及使用方法多樣，特別是血小板的濃度、是否進行活化以及活化方法的選擇。比較各研究中PRP功效的主要障礙是：（1）所有血小板產品都存在較大的供體變異，（2）血小板的濃度、是否進行活化以及活化方法的選擇沒有統一標準。有研究系統地驗證了不同血小板濃度對生長因子釋放和摻入PRP凝膠中的細胞的影響，也突顯了這一障礙[5]。這項研究結果表明，釋放的生長因子的濃度與血小板濃度密切相關，并且對MSC的活力和增殖有影響，對比分析后發現最有利的血小板濃度為1，000×103/μL（3.3到6.7倍）[5]。

2 復合支架應用于骨缺損修復

PRP最多用于骨組織工程領域，已作為細胞載體和/或成骨和成血管的生長因子來源。2005年Hokugo等人[15]報道PRP與可降解的生物材料凍干水基明膠結合具有促進體內骨修復的作用。在這項研究中，研究者將平均血小板濃度為1，200×103/μL（6倍）的兔PRP包被在凍干水基明膠上，結果表明，向明膠中添加PRP會導致血小板活化釋放生長因子，類似于凝血 酶活化。在兔尺骨缺損模型中測試了這種復合材料的成骨誘導特性，并與單獨使用明膠、單獨應用PRP或PRP結合纖維蛋白進行了比較，其中PRP復合明膠組新生骨形成最明顯。他們假設這種增強成骨的作用來源于凍干水基明膠可捕獲PRP釋放的生長因子，從而在水凝膠降解時持續釋放多種生長因子[15]。還有其他研究將PRP與各種陶瓷材料結合在一起。El Backly等[16]將PRP與羥基磷灰石-β-磷酸三鈣支架（SkeliteTM）結合使用，并在臨界大小的兔顱骨缺損中進行了測試。在支架上添加濃度為3，000×103/μL的凍干人PRP后，使用凝血酶和葡萄糖酸鈣激活。結果表明，激活PRP可提高顱骨缺損內的細胞及類骨質沉積，這歸因于PRP的化學吸引作用[16]。

骨組織工程還將PRP與細胞結合使用，其中PRP既可作為細胞載體，又可作為自體生長因子的供體來源。在Kretlow等人的研究中[17]將未培養的骨髓單個核細胞放于珊瑚羥基磷灰石支架或聚（L-乳酸）支架中，一組復合（8.6±3.2倍）PRP，一組不復合進行研究。在臨界大小的大鼠顱骨缺損模型中，骨髓單個核細胞對成骨具有促進作用，而復合PRP并不能增強成骨作用。與之相反，在納米硫酸鈣支架和BMP-2修飾的MSC中添加PRP（未指定血小板濃度）可促進成骨[18]。

除了促進成骨分化外，PRP還被用作MSC和內皮祖細胞的載體，以促進骨組織工程復合體中血管的形成[19]。這項研究證明了PRP（濃度2，000×103/μL）可作為內皮祖細胞的載體，皮下移植即可在植入物內促進新血管形成[17]。原因可能是PRP釋放的生長因子中血管生長因子的含量高[5]。Zahn等人最近的一項研究證明了PRP作為促血管生成細胞遞送載體的功能。[6]PRP凝膠（血小板濃度2，000×103/μL）能夠包裹人臍靜脈內皮細胞和MSC來形成血管樣結構。

3 骨軟骨及軟骨缺損修復

PRP在組織工程中的應用不僅限于骨組織。一些實驗已經研究了PRP在骨軟骨和軟骨修復中的作用。大多數研究都將PRP作為軟骨細胞或祖細胞的載體。例如，Xie等人[20]發表了一項對比實驗，檢測了PRP輸送的骨髓MSC和ASC的骨軟骨修復再生潛力。雖然單獨應用PRP（平均濃度為1，670×103/μL）不具有再生能力，但兩種細胞復合PRP均能介導軟骨基質的形成[20]。

4 牙科應用

在顱頜面部應用中特別進行了PRP的研究。一份臨床報告表明，在植入牙種植體后以PRP凝膠形式將MSC植入竇底以增強其功能，2至6年的隨訪期內顯示出積極的結果[19]。

5 軟組織修復

最近的流變學研究中已確定，PRP活化后會形成柔軟的水 凝膠[5]。它因此成為軟組織修復的最佳材料。PRP已被用于脂肪和皮膚損傷修復，并用作粘合劑來閉合傷口。例如，有研究顯示，固定在明膠微球上的PRP（平均富集6.4倍）可促進皮下植入后脂肪的血管形成[21]。據報道，由PRP、貧血小板血漿制備的冷沉淀、凝血酶混合產生的膜樣物質可作為生物活性粘合劑，在慢性潰瘍小鼠模型中介導傷口修復[22]。

6 總結

綜上，PRP已在各種組織工程研究中得到應用，并且結果不禁相同。在這些研究中對PRP的使用包括1.利用PRP作為自體水凝膠細胞載體2.用作促進細胞粘附、血管生成或組織再生的生長因子來源。對于后者，一些研究提示了在更長的時間內維持生長因子釋放的重要性，例如，使用明膠或肝素結合的纖維蛋白水凝膠包裹活化PRP來緩釋生長因子。不足的是大多數研究并未探究PRP的作用方式。此外，PRP一般會作為材料的一部分用于與細胞和生物材料復合，此類設計無法明確單個成分的作用。這些不足說明了在組織工程研究中PRP的作用特點、作用大小仍然不明確。

作為生長因子的自體遞送載體，PRP具有將組織工程學方法發展成為再生療法的固有部分的潛力。為了在臨床環境中PRP應用的安全性和可預測性，將來進行系統且深入的研究至關重要。