山羊痘病毒檢測方法分析

王裕鐵

（臨沭縣畜牧發(fā)展促進(jìn)中心，山東臨沭 276700）

山羊痘在羊群中的爆發(fā)率為50～80%之間，針對易感羊群致死率可達(dá)到58%甚至75%左右。由于山羊痘病毒毒性較強(qiáng)，一旦感染治愈率極低，不但會(huì)對羊群品質(zhì)帶來重大影響，而且當(dāng)妊娠期母羊染病后會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)等不良后果。因此，世界將其列為Ⅰ級羊群疾病，需引起養(yǎng)殖人員的高度重視。

1 山羊痘病毒的特性

山羊痘病毒作為羊痘病毒屬的一種類型，它的毒素較強(qiáng)，且致死率較高，尤其在羔羊感染中可達(dá)到100%死亡率。山羊痘病毒對干燥氣候有著突出的耐受力，在羊群結(jié)痂皮膚內(nèi)病毒仍可維持長達(dá)6個(gè)月毒性。而在高溫100℃情況下，山羊痘病毒也會(huì)在5min后失活。即使在日常防治過程中對其施用500ml/L濃度的酒精或者0.1g/L高錳酸鉀消毒劑，也需要確保消毒時(shí)間超過1h，否則不能有效消滅病毒。同時(shí)，對于感染山羊痘病毒的羊群，因其潛伏期最長可達(dá)到8d，故而無法起到及時(shí)預(yù)防的作用。通常在感染山羊痘病毒后，會(huì)出現(xiàn)1cm或1.5cm大小的圓狀紅斑，最終形成白色丘疹，對羊群健康造成極大危害。基于此，深入研究山羊痘病毒檢測方法具有較強(qiáng)的實(shí)踐意義。

2 山羊痘病毒的檢測方法

2.1 聚合酶檢測法

聚合酶檢測法是最為常見的山羊痘檢測法。相比之下具有較強(qiáng)的檢測敏感性與特異性。實(shí)際上聚合酶檢測法是通過體外酶促合成DNA的方法對山羊痘病毒加以檢測。

首先，在應(yīng)用聚合酶檢測法對山羊痘病毒進(jìn)行檢測時(shí)應(yīng)保持在一個(gè)不存在DNA污染環(huán)境下的專業(yè)PCR實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行操作。

其次，需準(zhǔn)確提取山羊痘病毒DNA，并設(shè)計(jì)引物。一般需保證引物長度處于15bp到30bp范圍內(nèi)，為了達(dá)到最佳檢測目的，還需把引物濃度控制在0.00025pM/ml。

最后，還應(yīng)規(guī)范檢測流程，比如現(xiàn)將山羊痘病毒混合液進(jìn)行離心處置，將其放在PCR檢測儀器上實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增。具體方法是現(xiàn)將其置于93℃之下約3min或5min，然后再以35次左右循環(huán)次數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)對山羊痘病毒實(shí)施40s的93℃、30s的58℃、60s的72℃溫度處理手段，最終在72℃環(huán)境下進(jìn)行7min保溫，從中可得出檢測結(jié)果。

2.2 反向間接血凝檢測法

反向間接血凝檢測法（RPHA）在具體檢測環(huán)節(jié)應(yīng)按照以下步驟進(jìn)行：

（1）提取病毒，應(yīng)對山羊痘病毒感染體出現(xiàn)病變細(xì)胞時(shí)進(jìn)行采集，并在病變率達(dá)到75%時(shí)及時(shí)將其收集起來，當(dāng)成檢測對照組樣品。

（2）制備抗原，可在山羊睪丸細(xì)胞上提取40ml山羊痘病毒培養(yǎng)液，并在轉(zhuǎn)速6000r/min、溫度4℃的條件下進(jìn)行長達(dá)30min的離心處置。待1d后利用酸堿值為7.2，且濃度為0.01mol/L的無菌洗脫液（含PBS）對其加以洗脫，經(jīng)過紫外光度計(jì)測器最終可分析出山羊痘病毒中含有的蛋白含量，并以此作為抗原制備基礎(chǔ)。

（3）分離血清，可提取20ml血清，并利用H8N2S水溶液進(jìn)行鹽析，由此在山羊痘活疫苗皮下分離出血清。從相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可知：RPHA法能夠達(dá)到80%左右的檢測效果，且靈敏度較高。因此，可將其作為一種易于操作的有效檢測方法。

2.3 雙重聚合酶檢測法

雙重聚合酶檢測法相比聚合酶檢測法經(jīng)濟(jì)性更強(qiáng)，且檢測效果更好。通常在應(yīng)用雙重聚合酶檢測法時(shí)具體可從熒光染料法與水解探針法展開深度研究。其中熒光染料法是將燃料與山羊DNA進(jìn)行雙鏈結(jié)合，并在光源照射下形成熒光信號，當(dāng)山羊痘病毒擴(kuò)增產(chǎn)物越多時(shí)所形成的熒光反應(yīng)強(qiáng)度就越大，由此得出可靠的病毒檢測結(jié)果。而在水解探針法中，是利用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶作為檢測基礎(chǔ)，由于它具有外切酶活性，針對DNA序列中核苷酸有著良好的裂解效果。因此，可妥善解決熒光染料法中存在的非特異性問題，進(jìn)而達(dá)到最佳檢測目的。在雙重聚合酶檢測的檢測過程中，若用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，可得出山羊痘病毒檢測濃度為0.0283ng/ml。

2.4 DNA分子生物檢測法

山羊痘病毒檢測是防治山羊痘最重要的部分。以往在山羊發(fā)病時(shí)，會(huì)借助血清學(xué)常規(guī)檢測法對其進(jìn)行檢測，但這樣會(huì)遭受抗體交叉風(fēng)險(xiǎn)，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，還有部分地區(qū)利用電鏡觀察法對山羊痘病毒特性進(jìn)行檢測，可因其設(shè)備價(jià)格過于昂貴，導(dǎo)致普及率不高。在此基礎(chǔ)上，DNA分子生物檢測法是快速檢測山羊痘病毒特異性與敏感性最有效的方法。它具體是在組織培養(yǎng)液中獲取山羊痘病毒DNA片段，并在酶切分析手段的輔助下實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測山羊痘病毒，從而為有關(guān)人員研究山羊痘治愈藥物提供重要依據(jù)。同時(shí)，還可利用DNA分子生物檢測法對已感染發(fā)病的山羊或已病死的山羊體內(nèi)殘留的山羊痘病毒進(jìn)行檢測，由此得出在防治山羊痘時(shí)應(yīng)重點(diǎn)弱化其毒性。

3 結(jié)論

綜上所述，我國對山羊痘病毒檢測工作一直予以高度重視。就目前發(fā)展趨勢來看，最為主要的檢測方法包括聚合酶檢測法、反向間接血凝檢測法、DNA分析生物檢測法等。為了取得更大的檢測成果，應(yīng)在現(xiàn)有基礎(chǔ)上加大研發(fā)力度。