小鼠常規(guī)采血方法在實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用

動(dòng)物疫病研究離不開模式動(dòng)物的使用，小鼠作為常用的模式動(dòng)物被獸醫(yī)工作者廣泛使用。通常小鼠血液被用于多方面研究如獸藥血藥濃度測(cè)定進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究、抗體等免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)采集以及病原致病力相關(guān)指標(biāo)評(píng)估等多方面，因此選擇不同的采血方法對(duì)實(shí)驗(yàn)相關(guān)重要，一般依據(jù)動(dòng)物福利、血樣要求、血量與采血頻次等因素，選擇適合的采血方法既保障獲得高質(zhì)量的血液樣本，又可減少對(duì)動(dòng)物的傷害。

1 常見的采血方法

小鼠作為模式動(dòng)物時(shí)，常用的采血方法依采血部位而命名，有眼眶下采血、頸靜脈采血、心臟采血和鼠尾采血。

1.1 眼眶下采血 眼眶采血是小鼠常用的采血方法，采血量一般在0.2～0.3mL，適用于多次重復(fù)采血。通常采血后需要給小鼠一段組織修復(fù)時(shí)間，單眼框采血修復(fù)期10d左右，時(shí)間太短會(huì)對(duì)采血量產(chǎn)生減少的影響。有驗(yàn)證顯示，多次眼眶下取血會(huì)引發(fā)眼眶組織損傷，使動(dòng)物出現(xiàn)臨床癥狀，表現(xiàn)為晝夜節(jié)律性失常，嚴(yán)重情況會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡。因，英國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物“3R”國際中心建議該方法作為實(shí)驗(yàn)終末期的采血或改為全麻條件下進(jìn)行實(shí)施采血。

1.2 頸靜脈采血 頸靜脈采血能夠采集到的血量約0.5mL。通過頸靜脈方式采血通常不需麻醉，實(shí)驗(yàn)人員可以直接穿刺點(diǎn)進(jìn)針采集血液，因此要求實(shí)驗(yàn)人員對(duì)該方法爛熟于心，操作技術(shù)精湛，操作過程小鼠容易掙扎，加大了采血難度，可能會(huì)造成皮下穿針導(dǎo)致皮下出血表現(xiàn)為淤青。要求采血量大，采血部位損傷小，也可以選擇麻醉后一次性真空采血，但是多次麻醉采血易損壞小鼠神經(jīng)系統(tǒng)。目前新興的套管技術(shù)可以彌補(bǔ)多次進(jìn)針的不足，在減少小鼠痛苦的同時(shí)連續(xù)采集大量高質(zhì)血液。頸靜脈采血單次量可達(dá)全身循環(huán)血量的15%，通常應(yīng)用在藥物代動(dòng)力學(xué)研究中，特別是頸靜脈套管技術(shù)的開展應(yīng)用，彌補(bǔ)了連續(xù)多次采血導(dǎo)致的缺陷。

1.3 心臟采血 一般心臟采血所采集的血液為無菌血，采血量很大，單次可以采集小鼠血量0.8mL，該方法需要麻醉配合實(shí)施采集，采血時(shí)應(yīng)選擇小鼠胸部左側(cè)心臟跳動(dòng)最強(qiáng)位置處進(jìn)針，進(jìn)針后緩慢回抽針筒使得血液回流入針管，注意針頭處于低位可以避免空氣進(jìn)入心臟。有研究發(fā)現(xiàn)心臟采血后，雌雄小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)有顯著性差異。心臟采血采使得進(jìn)行循環(huán)的血液減少，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物劇烈疼痛或者引發(fā)心包出血甚至心包填塞，如有空氣進(jìn)入心臟會(huì)導(dǎo)致小鼠因空氣栓塞而死，因此該法推薦只作為實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诓裳且虿裳看笤摲ū绕渌麘?yīng)用于實(shí)驗(yàn)終末的采血方法有其優(yōu)越性。

1.4 鼠尾采血 鼠尾采血可以細(xì)分尾尖采血、鼠尾刺血以及尾靜脈穿刺采血，適用用于少量多次長期采血。尾尖采血俗稱剪尾采血，采血量極少一次采血最多0.2mL，可剪尾巴長度不超過1mm，采集的血液為動(dòng)脈血和靜脈混合物，不適用于老齡小鼠。鼠尾刺血可以采集小鼠單次最多0.15mL，通常選用注射器進(jìn)行采血，采血過程需要注意注射器的抽拉速度，過快的抽動(dòng)注射器會(huì)導(dǎo)致血管回縮血液溢出，對(duì)注射器抽拉速度不容易控制，有研究人員將注射器采血針更改為真空采血管進(jìn)行采血，可避免因抽拉注射器不均勻而產(chǎn)生的失敗風(fēng)險(xiǎn)。從保障動(dòng)物福利考慮鼠尾采血應(yīng)用于血量需求少的連續(xù)采集，如血常規(guī)、血糖監(jiān)測(cè)、抗體生成檢測(cè)等微量動(dòng)態(tài)檢測(cè)過程。

2 采血方法的選擇

因不同的采血方法導(dǎo)致的采血量不同以及血液組成有差別，且對(duì)小鼠的傷害也不同，所以我們?cè)谶x擇合適的采血方法時(shí)，應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嘟Y(jié)合，選擇最佳的采血方式，盡可能保護(hù)動(dòng)物福利的同時(shí)滿足我們的實(shí)驗(yàn)需求。

2.1 采血量的影響因素 正常的實(shí)驗(yàn)小鼠的循環(huán)血容量在63～80mL/kg范圍內(nèi)，小鼠的采血量與其體重，采血次數(shù)，采血時(shí)間間隔，以及喂養(yǎng)補(bǔ)液均一有關(guān)系。同種小鼠雌雄體，采血方式和位點(diǎn)、操作者的熟練程度均影響血液的采出量。通常4周內(nèi)可以采集小鼠血量為其循環(huán)血量的10%左右，1周內(nèi)可以采集到循環(huán)血量的5%左右， 而24h僅僅可以出采集循環(huán)血量的1%。

2.2 不同采血方法與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利 實(shí)施動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)充分考慮采血方式對(duì)動(dòng)物造成的損害，盡量保障小鼠的動(dòng)物福利，在“3R”原則的基礎(chǔ)之上，盡可能的應(yīng)用對(duì)小鼠疼痛、組織損傷以及壓力最小的采血方式。有研究比較頸靜脈穿刺和尾靜脈切割兩種采血方法對(duì)小鼠的損害，研究顯示尾靜脈切割較頸靜脈穿刺所采集的血液會(huì)更易產(chǎn)生溶血，但是這兩種方法對(duì)小鼠產(chǎn)生的壓力近似，因此頸靜脈采血在血液變量等相關(guān)科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中更適合多次連續(xù)的大量采血。

綜上所述，因不同實(shí)驗(yàn)所需要目的檢測(cè)的參數(shù)各有不同，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)者應(yīng)該按照自身的實(shí)驗(yàn)屬性（諸如是否有凝血相關(guān)功能要求等）優(yōu)化選擇匹配的采血方法，盡量避免因認(rèn)為選擇不當(dāng)導(dǎo)致小鼠發(fā)生各種致殘，致傷等損害。在選擇適合的采血方法前，應(yīng)該首先明確實(shí)驗(yàn)研究所需的血液樣本的特點(diǎn)屬性，其次確定最佳采血組織部位以及采血頻率等，實(shí)驗(yàn)員應(yīng)熟練掌握所需的采血技能，保障實(shí)驗(yàn)的合理進(jìn)行，同時(shí)最大程度上降低血樣對(duì)結(jié)果的影響。