CAR-T細(xì)胞在實體腫瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)展

曹玉環(huán)，苑學(xué)禮

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，哈爾濱 150001)

嵌合抗原受體T細(xì)胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T細(xì)胞)免疫療法來源于過繼性T細(xì)胞療法，現(xiàn)有3種形式的過繼性T細(xì)胞療法用于癌癥治療，包括腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞療法、T細(xì)胞受體工程化T細(xì)胞療法、CAR-T細(xì)胞療法[1]。隨著細(xì)胞工程技術(shù)的快速進(jìn)展，CAR-T細(xì)胞免疫療法在臨床中除頑固腫瘤外均取得了持久的臨床療效，表現(xiàn)出巨大的潛力。自應(yīng)用T細(xì)胞工程構(gòu)建成功CD19 CAR-T細(xì)胞后，其被美國食品藥品管理局批準(zhǔn)用于治療頑固性前-B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和擴(kuò)散大B細(xì)胞淋巴瘤[2-3]。與血液腫瘤不同，實體腫瘤微環(huán)境中存在大量的纖維基質(zhì)和免疫抑制細(xì)胞，同時通過物理屏障和免疫屏障保護(hù)腫瘤組織、抵抗免疫細(xì)胞的攻擊。目前，科學(xué)家們正在嘗試各種辦法克服這些問題，如研發(fā)靶向成纖維細(xì)胞活化蛋白的CAR-T細(xì)胞以減少腫瘤周圍纖維結(jié)締組織的形成來增加淋巴細(xì)胞浸潤，制備靶向免疫檢查點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞等。除屏障外，實體腫瘤周圍往往伴隨血管畸形和纖維結(jié)締組織增生，形成低氧、酸性、缺乏必需氨基酸(精氨酸、色氨酸等)的微環(huán)境。在這種環(huán)境下，浸潤T細(xì)胞存活困難、激活障礙，較難達(dá)到理想的腫瘤殺傷效果。精氨酸和色氨酸是T 細(xì)胞激活所需要的重要物質(zhì)，而腫瘤細(xì)胞和骨髓細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中能夠分泌精氨酸酶和吲哚胺2，3-二氧化酶來分解精氨酸和色氨酸，阻礙T細(xì)胞的增殖和持續(xù)激活[4]。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)母細(xì)胞瘤可通過過表達(dá)精氨酸酶Ⅱ抑制靶向雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂2(disialoganglioside 2，GD2)的CAR-T細(xì)胞在微環(huán)境內(nèi)的增殖[5]。這為突破這一難題提供了新思路。有研究顯示，抑制吲哚胺2，3-二氧化酶活性后，CAR-T細(xì)胞的增殖和殺傷能力均增強(qiáng)、分泌細(xì)胞因子增加[6]。現(xiàn)就CAR-T細(xì)胞在實體腫瘤治療中的應(yīng)用進(jìn)展予以綜述。

1 CAR的概述

CAR由Gross等[1]于1989年首次提出，它的基本結(jié)構(gòu)包括識別胞外抗原的單鏈可變區(qū)片段(single-chain fragment variable，scFv)、源于CD8α或CD28等序列連接胞外抗原和胞內(nèi)信號肽區(qū)的跨膜結(jié)構(gòu)域及激活和傳遞T細(xì)胞活化信號功能的胞內(nèi)共刺激信號結(jié)構(gòu)域，其中共刺激信號結(jié)構(gòu)域通常由CD28受體家族的CD28、可誘導(dǎo)共刺激分子或腫瘤壞死因子受體家族的4-1BB、OX40、CD27以及CD3ζ等相關(guān)序列組成。目前，研究者們根據(jù)胞內(nèi)共刺激序列的種類、數(shù)量以及是否經(jīng)過特定的基因修飾[如連接細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17、IL-12、IL-18以分泌γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α等或連接表達(dá)抗程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)單抗的scFv]將CAR-T細(xì)胞分為四代[4，7](表1)。

表1 不同代次CAR-T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

近年來，CAR-T細(xì)胞因高度的特異性以及強(qiáng)大的抗腫瘤免疫功能被廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤的實驗研究和臨床治療。其中研究最廣泛、療效較好的為CD19 CAR-T細(xì)胞[8]，且2017年美國食品藥品管理局、2018年歐洲藥品管理局先后批準(zhǔn)了兩個相關(guān)產(chǎn)品Kymriah和Yescarta上市用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的臨床治療。雖然CAR-T細(xì)胞在血液系統(tǒng)腫瘤領(lǐng)域取得較好的療效，但其在實體腫瘤治療方面的臨床試驗結(jié)果卻不理想，仍面臨著許多問題。

2 CAR-T細(xì)胞在實體腫瘤中的應(yīng)用

目前，用于CAR-T細(xì)胞治療研究的靶點(diǎn)十分繁雜，包括經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物，新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原，以及一些在正常組織細(xì)胞也能較高表達(dá)的靶點(diǎn)分子(如細(xì)胞分化簇抗原)等。因腫瘤特異性高低差異性較大，現(xiàn)依據(jù)靶點(diǎn)類型對CAR-T細(xì)胞進(jìn)行分類(表2)。

2.1CD類靶點(diǎn) 雖然絕大部分的CD類靶點(diǎn)主要被應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤及淋巴瘤的研究中，但近幾年其在實體腫瘤中的研究也在不斷開展。CD70是一種糖基化跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體家族中的一員[9]。研究發(fā)現(xiàn)，天然的CD70僅表達(dá)于極度活化的T、B淋巴細(xì)胞和一小部分成熟的樹突狀細(xì)胞，因受免疫抑制作用的影響很少在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，但在某些惡性血液病及實體腫瘤中存在異位表達(dá)現(xiàn)象[10-12]。2019年9月佛羅里達(dá)大學(xué)威爾斯神經(jīng)外科與哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科聯(lián)合研究[13]，發(fā)現(xiàn)有70%的同系膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型可表達(dá)CD70，隨后他們將IL-8(也稱為CXC趨化因子配體8)受體(CXC趨化因子受體1和CXC趨化因子受體2)修飾的CD70 CAR-T應(yīng)用于該小鼠模型的治療，結(jié)果顯示近40%的小鼠被治愈，表明CAR-T細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)。其原因為經(jīng)IL-8誘導(dǎo)修飾后的CAR-T細(xì)胞能更多地向腫瘤部位遷移聚集，因此后期他們通過電離輻射的手段來刺激IL-8的分泌以達(dá)到更佳的抗腫瘤效應(yīng)。除膠質(zhì)母細(xì)胞瘤外，他們還在卵巢癌及胰腺癌中應(yīng)用了CD70 CAR-T細(xì)胞并觀察到類似結(jié)果，證明了CD70作為相關(guān)靶點(diǎn)治療實體腫瘤的有效性。

除CD70外，紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心的研究者們構(gòu)建了一種CD40配體(CD40 ligand，CD40L)CAR-T細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD40/CD40L介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和持續(xù)誘導(dǎo)的內(nèi)源性免疫反應(yīng)可引起抗原丟失來規(guī)避腫瘤的免疫逃逸機(jī)制，從而達(dá)到更優(yōu)的抗腫瘤效應(yīng)[14]。除CD40L外，還有許多其他同類靶點(diǎn)被研究應(yīng)用。

2.2經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物類靶點(diǎn) 前列腺癌是最常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率隨年齡的增長而增加，嚴(yán)重威脅著人類健康。前列腺特異性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)是一種前列腺相關(guān)抗原，具有較高的特異性和膜結(jié)合性，在前列腺癌尤其是非激素依賴型前列腺癌及其轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)[15]。Ma等[16]利用此靶點(diǎn)制備了第一代和第二代PSMA CAR-T細(xì)胞，并通過試驗發(fā)現(xiàn)第二代較第一代具有更強(qiáng)的腫瘤殺傷作用，且能分泌更多的細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-2等)。Junghans等[17]為6例轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性及激素難治的前列腺癌患者中的5例注射了靶向PSMA的第一代CAR-T細(xì)胞，同時給予低劑量IL-2，結(jié)果顯示5例患者均未發(fā)生明顯的不良反應(yīng)且其中2例還獲得了部分反應(yīng)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)患者的應(yīng)答情況與輸注的CAR-T細(xì)胞量成反比，但與IL-2水平直接相關(guān)，推測可能與大量的CAR-T細(xì)胞會消耗較多的IL-2有關(guān)。

表2 靶點(diǎn)類型、相關(guān)靶點(diǎn)及應(yīng)用腫瘤

為了避免在人類中應(yīng)用含有傳統(tǒng)鼠源性scFv的CAR所引起的潛在免疫抑制反應(yīng)，研究者們首次使用駱駝科動物納米抗體構(gòu)建了新型的PSMA CAR-T細(xì)胞，結(jié)果證實該T細(xì)胞不僅可以特異性殺傷PSMA+細(xì)胞，還可刺激細(xì)胞因子IL-2的分泌及CD69、CD107a(自然殺傷細(xì)胞抑制性受體)表達(dá)上調(diào)[18]。同時，他們還發(fā)現(xiàn)該T細(xì)胞與PSMA+細(xì)胞共培養(yǎng)時增殖率較之前增加了約0.6倍，表明了新型CAR-T細(xì)胞的治療優(yōu)勢。

此外，還有前列腺干細(xì)胞抗原在前列腺癌[19]、癌胚抗原在結(jié)直腸癌[20]、甲胎蛋白主要組織相容性復(fù)合體復(fù)合物在肝癌[21]等一系列的相關(guān)研究。

2.3生長因子、細(xì)胞因子、激素受體及其突變體和類受體類靶點(diǎn)

2.3.1表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)及EGFRⅢ型突變體(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ) CAR-T細(xì)胞 EGFR是一種受體酪氨酸激酶，其異常表達(dá)可能與包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌在內(nèi)的上皮來源性腫瘤相關(guān)[22]，研究顯示其在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)率超過了50%[23]。EGFRvⅢ 是最常見的EGFR突變體，它僅在腫瘤組織中表達(dá)而在正常組織中極少表達(dá)[24]。有研究者將傳統(tǒng)的抗EGFR及EGFRvⅢ CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于相關(guān)腫瘤的小鼠模型中進(jìn)行實驗研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些CAR-T細(xì)胞對相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞均能起到一定的殺傷作用，證明了這些CAR-T細(xì)胞的有效性[25-26]。

在前期試驗的基礎(chǔ)上，Sampson等[27]通過基因工程改造構(gòu)建了新的第三代EGFRvⅢ 信使RNA CAR-T細(xì)胞并在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系小鼠模型中進(jìn)行了實驗，他們發(fā)現(xiàn)該信使RNA CAR-T細(xì)胞不僅能殺傷腫瘤細(xì)胞，還能預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)。Choi等[28]構(gòu)建了另一種新型雙順反子式EGFRvⅢ CAR，該CAR可以表達(dá)一種針對EGFR的雙特異性T細(xì)胞銜接子，即在重定向CAR-T細(xì)胞的同時還可募集未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞來對抗野生型EGFR，這樣既可以消除EGFRvⅢ陽性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤又可以消除EGFRvⅢ陰性EGFR陽性的異源性腫瘤。同年，上海交通大學(xué)癌基因研究中心[29]也構(gòu)建了一種新的806-28Z CAR-T細(xì)胞，他們同樣驗證了其對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的殺傷作用；且經(jīng)分析還發(fā)現(xiàn)，該T細(xì)胞劑量不同對EGFRvⅢ陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷作用也不同，低劑量時僅抑制腫瘤細(xì)胞生長，而高劑量時才發(fā)揮殺傷作用甚至治愈荷瘤小鼠，同時被治愈的小鼠還可獲得對抗該腫瘤細(xì)胞的記憶。

除膠質(zhì)瘤外，一項研究還顯示了靶向EGFRvⅢ的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)及體外對表達(dá)EGFRvⅢ的肺癌細(xì)胞也具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)[30]。

2.3.2人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor，HER)2 CAR-T細(xì)胞 HER2同屬ErbB家族，可在多種腫瘤中過表達(dá)，且其異常激活與癌癥預(yù)后密切相關(guān)[31]，是近年研究較為廣泛的靶點(diǎn)之一。前期研究者們進(jìn)行了大量的試驗驗證了抗HER2 CAR-T細(xì)胞對HER2陽性細(xì)胞的有效性，但還有研究顯示因使用鼠源性scFv構(gòu)建CAR導(dǎo)致宿主產(chǎn)生了強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)而被限制臨床使用[32]。針對此Sun等[33]嘗試構(gòu)建了含人源化scFv的chA21-28z HER2 CAR-T細(xì)胞，該T細(xì)胞在體內(nèi)及體外對HER2+乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞均具有較強(qiáng)的殺傷作用，且還減少了免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。另有學(xué)者利用來源于結(jié)腸癌患者的異種移植物模擬建立了更接近于真實患者的小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗HER2 CAR-T細(xì)胞在消除異種移植物后進(jìn)一步將相關(guān)的腫瘤細(xì)胞消除，同時還預(yù)防了本批次實驗小鼠結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)[34]。

此類靶點(diǎn)除了研究較為廣泛的EGFR、EGFRvⅢ 及HER2外，還有促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2[35]、IL-13受體α2[36-37]、自然細(xì)胞毒性受體[38]、葉酸受體α亞型[39]、受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1[40]等。

2.4腫瘤相關(guān)的糖蛋白、蛋白及糖脂類靶點(diǎn)

2.4.1間皮素CAR-T細(xì)胞 間皮素是一種細(xì)胞表面糖蛋白，其在間皮瘤、胰腺癌、胃癌、卵巢癌及肺癌等癌細(xì)胞表面表達(dá)水平較高[41-42]。2014年，賓夕法尼亞大學(xué)艾布拉姆森癌癥中心的研究人員首次利用信使RNA電穿孔技術(shù)獲得了瞬時表達(dá)的T細(xì)胞制備了新的CAR-T細(xì)胞，然后分別以靜脈和瘤內(nèi)兩種不同的注射方式將其應(yīng)用于晚期惡性胸膜間皮瘤及轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該T細(xì)胞在發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的同時還避免了CAR-T細(xì)胞治療中最常見的靶外毒性反應(yīng)的發(fā)生[43]。

有研究者利用間皮素scFv、CD3ζ、CD28和DAP10細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域(M28z10)構(gòu)建了一種靶向間皮素的CAR-T細(xì)胞即M28z10 T細(xì)胞，得出該T細(xì)胞對多種胃癌細(xì)胞系均有強(qiáng)大的抗腫瘤功效，且對轉(zhuǎn)移性胃癌也同樣起作用[44]。同時，他們還發(fā)現(xiàn)腫瘤局部給藥較全身靜脈給藥能更早地促使T細(xì)胞浸潤到腫瘤組織中。這說明注射部位的不同也影響CAR-T細(xì)胞的作用，應(yīng)盡可能減少CAR-T細(xì)胞在運(yùn)輸過程中的損耗以達(dá)到更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)。

2.4.2磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3，GPC3) CAR-T細(xì)胞 GPC3是一種硫酸乙酰肝素蛋白多糖，在細(xì)胞的生長、分化和遷移中起重要作用[45]，這種蛋白多糖在正常組織中幾乎不表達(dá)，而在肺癌、肝癌、黑色素瘤等腫瘤中高表達(dá)，且表達(dá)越強(qiáng)預(yù)示著腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的可能性越大[46]。Li等[47]利用慢病毒制備了第三代抗GPC3 CAR-T細(xì)胞，并驗證了其在體內(nèi)外對GPC3+肺鱗狀細(xì)胞癌均具有顯著的抗腫瘤效應(yīng)，同時他們還觀察到在腫瘤細(xì)胞被裂解時可檢測到IFN-γ、IL-2、腫瘤壞死因子-α、IL-4及IL-10等細(xì)胞因子分泌增加。隨后，上海市腫瘤研究所的研究人員[48]在喉鱗狀細(xì)胞癌的小鼠模型中再次驗證了第三代抗GPC3 CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。

有研究者利用一種能夠誘導(dǎo)表達(dá)IL-12的人或鼠源性GPC3特異性T細(xì)胞即GPC3-28Z-NFAT-IL-12-T細(xì)胞來對抗GPC3+腫瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示該T細(xì)胞不僅可以裂解腫瘤細(xì)胞還可以促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌；且與體外試驗相比，其在體內(nèi)具有更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)[49]，這可能由于修飾后的T細(xì)胞可分泌IL-12，從而促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生使得T細(xì)胞能夠持久地浸潤于腫瘤組織發(fā)揮作用。同時他們還發(fā)現(xiàn)，分泌的IL-12減少了已建腫瘤模型中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的浸潤；且在具有免疫能力的宿主中，低劑量的GPC3-28Z-NFAT-IL-12-T細(xì)胞無須事先調(diào)節(jié)就可以發(fā)揮抗腫瘤功效。

2.4.3GD2 CAR-T細(xì)胞 GD2是一種雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂，在幾乎所有的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，并可能在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮作用[50-51]。近幾年開展的一些研究也驗證了抗GD2 CAR-T細(xì)胞在高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤、擴(kuò)散型內(nèi)因性腦橋神經(jīng)膠質(zhì)瘤等神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤方面的有效性[52-53]。Prapa等[54]將衍生自IgM類鼠源抗體的抗GD2 scFv通過人CD8α鉸鏈跨膜結(jié)構(gòu)域與共刺激分子4-1BB(CD137)、CD3-ζ信號結(jié)構(gòu)域相連接構(gòu)建了新的CAR-T細(xì)胞，該CAR-T細(xì)胞結(jié)合了抗GD2 scFv的特性和4-1BB分子驅(qū)動的有效共刺激性，在體內(nèi)外對GD2陽性神經(jīng)母細(xì)胞瘤顯示出較強(qiáng)的殺傷作用。

Chen等[55]將抗GD2 CAR-T細(xì)胞進(jìn)行了改造即為其優(yōu)化添加了細(xì)胞因子IL-15，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改造后的T細(xì)胞在與相關(guān)抗原結(jié)合前能更持續(xù)有效地存活下來而不被滅活，同時還能向腫瘤部位提供額外的細(xì)胞因子傳導(dǎo)信號。同時，它還可以減少程序性細(xì)胞死亡受體1的表達(dá)、富集干細(xì)胞樣細(xì)胞及對體內(nèi)外反復(fù)暴露的腫瘤發(fā)揮出優(yōu)于傳統(tǒng)抗GD2 CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)等。這項研究再次表明了細(xì)胞因子在CAR-T細(xì)胞治療中的重要性，今后可以考慮通過篩選將有效的細(xì)胞因子以最佳的方式添加至CAR-T細(xì)胞以促使它們發(fā)揮協(xié)同作用來制備出更強(qiáng)的抗腫瘤“武器”，但與此同時應(yīng)密切監(jiān)測細(xì)胞因子水平的變化，以防止細(xì)胞因子釋放綜合征的發(fā)生。

此外，同類相關(guān)靶點(diǎn)黏蛋白1[56]、黏蛋白16[57]、硫酸軟骨素蛋白多糖4[58]、碳酸酐酶Ⅸ[59]、糖蛋白100[60]、肝素酶[61]等也被應(yīng)用于相關(guān)的實體腫瘤。

2.5細(xì)胞黏附分子及細(xì)胞間連接相關(guān)分子類靶點(diǎn) 細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)是一種跨膜分子，是免疫球蛋白超家族中的一員，它參與了細(xì)胞間內(nèi)皮遷移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、極性和穩(wěn)定性的維持等重要過程。同時其可溶性部分在炎癥、慢性疾病和許多惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)[62]。Min等[63]針對該靶點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)研究，首先他們構(gòu)建了第三代ICAM-1特異性CAR-T細(xì)胞，然后將其應(yīng)用于間變性甲狀腺癌異種移植小鼠模型中，結(jié)果觀察到此T細(xì)胞具有強(qiáng)大而持久的腫瘤根除作用。同一時期，Park等[64]研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞在體外的抗腫瘤效力與CAR的親和力及ICAM-1的密度呈正相關(guān)，即微摩爾親和力的CAR-T細(xì)胞較納摩爾的同類物能發(fā)揮更優(yōu)的抗腫瘤功效。

除此之外，還有L1細(xì)胞黏附分子特異性CAR-T細(xì)胞被用于兒童復(fù)發(fā)性或難治性成神經(jīng)細(xì)胞瘤的治療中[65]；上皮細(xì)胞黏附分子特異性CAR-T細(xì)胞被應(yīng)用于乳腺癌(NCT02915445)、肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌及前列腺癌(NCT03013712)的臨床試驗招募研究中等。

2.6其他腫瘤特異性或相關(guān)性抗原類靶點(diǎn) 除上述幾大類靶點(diǎn)外，其他與腫瘤密切相關(guān)的靶點(diǎn)研究也在不斷開展中，如紐約食管鱗狀細(xì)胞癌1靶點(diǎn)在肺癌、卵巢癌和骨腫瘤中的臨床試驗也在招募中(NCT03029273)。

目前，CAR-T細(xì)胞治療實體腫瘤的相關(guān)靶點(diǎn)選擇呈現(xiàn)多元化，這也是由實體腫瘤本身具有的豐富異質(zhì)性所決定的。隨著抗原合成、篩選、構(gòu)象分析等技術(shù)的發(fā)展和腫瘤靶抗原的不斷更新，未來實體腫瘤靶點(diǎn)的選擇性將更多元化。

3 CAR-T細(xì)胞治療在實體腫瘤應(yīng)用中面臨的問題及可能的解決策略

3.1靶點(diǎn)的選擇 CAR-T細(xì)胞應(yīng)用于惡性腫瘤治療的前提是靶抗原的選擇。理想的靶抗原應(yīng)只在腫瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)而在正常組織中不表達(dá)或表達(dá)水平極低，但由于實體腫瘤表面存在異質(zhì)抗原，很難找到符合這一標(biāo)準(zhǔn)的靶抗原，由此引起了靶外或靶向毒性，如EGFR和HER2靶點(diǎn)除了在腫瘤組織中表達(dá)外還在正常的心肺組織表達(dá)，這就導(dǎo)致了靶向該靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞對心肺組織的“誤傷”[2]。

為了克服這一難題，研究者們嘗試了多種方案，如通過RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)或基因工程將自殺基因?qū)胍垣@得瞬時表達(dá)的CAR-T細(xì)胞以減輕其對正常組織的損害[66-67]，或在CAR的抗原識別結(jié)合區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)之間連接一個“開關(guān)”裝置，使其在需要時觸發(fā)“開關(guān)”開始“工作”，而不需要時處于“關(guān)閉”無效狀態(tài)[68]。此外，還可以為CAR串聯(lián)雙特異性靶抗原，只有當(dāng)其與所有抗原同時結(jié)合時才能被充分活化發(fā)揮殺傷作用[48，69]。

3.2CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的增殖存活 研究發(fā)現(xiàn)，在慢性淋巴細(xì)胞白血病的患者中CD19 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)增和存活時間與患者對該細(xì)胞的應(yīng)答呈正相關(guān)，增殖速度越快、持續(xù)存在時間越久，該細(xì)胞在患者體內(nèi)的有效應(yīng)答越持久[70]。然而，與血液系統(tǒng)腫瘤相比，CAR-T細(xì)胞在實體腫瘤中的增殖存活情況并不樂觀[39，65]。目前影響CAR-T細(xì)胞在實體瘤患者體內(nèi)存活的因素尚不明確，考慮可能與CAR-T細(xì)胞的分化和功能狀態(tài)、CAR與靶點(diǎn)的親和力、CAR的免疫原性及患者的自身因素相關(guān)[71]。

Guedan等[72]通過研究證明，可誘導(dǎo)共刺激分子細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)域可以大大增強(qiáng)CD4+CAR -T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性，進(jìn)而提高表達(dá)CD28或4-1BB的CD8+CAR-T細(xì)胞的持久性，隨后他們驗證了結(jié)合可誘導(dǎo)共刺激分子和4-1BB胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的第三代CAR-T細(xì)胞除了表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤作用外，在體內(nèi)的持久性也提高。這表明，通過改造CAR的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可改善CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性，但具體改造措施仍需不斷研究。

3.3CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的運(yùn)輸 如何將CAR-T細(xì)胞有效地運(yùn)輸至腫瘤部位是CAR-T細(xì)胞在實體腫瘤中應(yīng)用的又一難題。這一難題是由于存在于實體瘤周圍的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞數(shù)量較少，需通過規(guī)避腫瘤T細(xì)胞的免疫排斥機(jī)制來促使CAR-T細(xì)胞浸潤到腫瘤組織中[71]。針對此問題研究者們探索了一系列可行策略，如在CAR-T細(xì)胞中添加腫瘤細(xì)胞特異性趨化因子來增加其向腫瘤部位的募集[73-75]，或改善腫瘤周圍的細(xì)胞、組織、血供等來增加CAR-T細(xì)胞在腫瘤部位的浸潤[61，76-78]等。除上述策略外，未來仍需積極探索其他可行策略。

3.4腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用很大程度地限制了CAR-T細(xì)胞在實體腫瘤中的臨床應(yīng)用。首先，腫瘤微環(huán)境中存在一些免疫抑制點(diǎn)分子(程序性細(xì)胞死亡受體1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4)，它們會抑制T細(xì)胞的活性[79]；其次，腫瘤的惡化及其體積與重量的增加也會改變腫瘤周圍的微環(huán)境，使其產(chǎn)生免疫耐受的現(xiàn)象，即使CAR-T細(xì)胞被成功地運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位也會被抑制滅活[80]；同時，實體腫瘤中還存在阻礙CAR-T細(xì)胞向腫瘤部位有效滲透和浸潤的周圍基質(zhì)及異常脈管系統(tǒng)[2]；另外，腫瘤引起的缺氧、低營養(yǎng)狀態(tài)以及高濃度代謝酸也均使得T細(xì)胞無法增殖產(chǎn)生細(xì)胞因子[81]；最后腫瘤浸潤液中還富含調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、髓樣抑制細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞等，它們分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β、IL-10、硝酸和吲哚胺2，3-二氧化酶等均會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[82]。

為了改善因腫瘤微環(huán)境引起的免疫抑制作用，研究者使用連接抗PD-L1單抗的scFv序列構(gòu)建了新的CAR-T細(xì)胞，該CAR-T細(xì)胞在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時還分泌了抗PD-L1單抗使之與腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1分子結(jié)合以解除免疫抑制狀態(tài)[7]；另有研究者利用基因編輯技術(shù)將CAR-T細(xì)胞表面表達(dá)程序性細(xì)胞死亡受體1的基因去除以解除免疫抑制作用[83]等。

4 小 結(jié)

CAR-T細(xì)胞在血液系統(tǒng)腫瘤領(lǐng)域取得了較大進(jìn)展，這也激發(fā)了許多研究者對CAR-T技術(shù)在實體腫瘤中運(yùn)用研究的興趣，多項CAR-T細(xì)胞治療實體腫瘤的基礎(chǔ)和早期臨床試驗正在開展。但CAR-T細(xì)胞研究中的T細(xì)胞設(shè)計、基因編碼和細(xì)胞生產(chǎn)均是T細(xì)胞療法潛在的負(fù)擔(dān)，由于缺乏非臨床試驗資料，導(dǎo)致不能有效評估項目的安全性和有效性，不能預(yù)見早期臨床試驗中可能遇到的安全性問題，導(dǎo)致其在實體腫瘤中的應(yīng)用仍較困難。相信在不久的將來將出現(xiàn)更加成熟、安全和有效的CAR-T細(xì)胞治療技術(shù)。