腫瘤相關中性粒細胞在結直腸癌中的作用

朱志達，朱安龍

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院結腸直腸外科，哈爾濱 150001)

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球最常見的癌癥之一，現居癌癥死亡原因的第三位[1]。近年來雖然外科技術有所提升，化療藥物和分子靶向藥物的研究也有所突破和進展，但CRC患者的數量仍逐年增加。研究顯示，約20%的CRC患者在確診時已出現轉移，是導致患者死亡的主要原因之一[2]。一旦腫瘤擴散到遠處器官，無論是傳統化療還是靶向治療均無法治愈。因此，了解CRC轉移機制、尋找與遠處轉移相關靶點非常重要。

目前，有關癌細胞在機體環境中生存并形成轉移的確切機制仍不清楚。據報道，幾種類型的宿主細胞，如成纖維細胞、巨噬細胞[腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)]、間充質干細胞等在腫瘤微環境中發揮重要作用[3]。此外，一些被稱為腫瘤相關中性粒細胞(tumor-associated neutrophils,TANs)的細胞群體可以支持癌細胞的生長、侵襲及血管生成。中性粒細胞是機體防御外來致病源的第一道防線，是機體免疫系統的重要組分之一。但有研究表明，中性粒細胞在腫瘤轉移中發揮支持作用[4]。不同的細胞因子作用于微環境可使TANs產生不同的分化表型，進而產生不同的作用。現就TANs在CRC中的作用予以綜述。

1 TANs概述

1.1TANs分型 腫瘤微環境在促進腫瘤轉移中發揮重要作用,對后續的治療及總體生存率有顯著影響。作為腫瘤微環境中的一個關鍵因子，TANs在癌癥發生發展中起重要的調節作用[5]。研究表明，腫瘤微環境的各種刺激激活了TANs的不同表型，其既能夠分化成抗腫瘤的N1表型，也能夠分化成促腫瘤的N2表型[6]。盡管功能上存在差異，但尚未有明確的表面標志物能區分N1和N2表型的TANs，不同表型的表面標志物、轉錄調節因子以及細胞因子譜仍有待研究。N1表型的TANs通過產生腫瘤壞死因子-α、細胞間黏附分子1、活性氧類、死亡受體，并減少精氨酸酶的表達，增加細胞毒性，降低免疫抑制能力，發揮抗腫瘤作用[7]。而N2表型的中性粒細胞通過表達精氨酸酶、基質金屬蛋白酶9、血管內皮生長因子及多種趨化因子支持腫瘤擴展[8]。TANs分化表型的差異與腫瘤微環境中的信號分子有很大關系。Fridlender等[9]報道，轉化生長因子-β信號通路在N1與N2表型間起調節作用：腫瘤內的轉化生長因子-β使分化傾向于N2表型，而抑制轉化生長因子-β則誘導N1表型表達。有文獻報道，在肺癌中小劑量β干擾素可誘導N1表型分化，提高肺內中性粒細胞的抗腫瘤活性[10]；在小鼠腫瘤模型中，β干擾素治療后中性粒細胞抗腫瘤特性增強，遷移能力降低，提示β干擾素治療有效[11]。

1.2TANs的募集 腫瘤微環境中的腫瘤細胞與中性粒細胞的相互作用常通過趨化因子受體與配體的相互作用完成。多種免疫細胞(包括中性粒細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞、T細胞、B細胞)浸潤腫瘤，并參與腫瘤微環境與其他非免疫基質細胞的調節[12]。來源于骨髓的細胞(包括TAMs、TANs和髓源性抑制細胞)有助于腫瘤進展[13]。免疫組織化學分析表明，中性粒細胞與各種癌組織混雜在一起受趨化因子的調節[14]。趨化因子由腫瘤細胞生成，是一種與G蛋白偶聯受體結合的小肽，可誘導趨化、炎癥和(或)血管生成，是促進腫瘤轉移的關鍵因素之一[15]。腫瘤細胞常產生多種炎癥趨化因子，包括吸引中性粒細胞的趨化因子，促進TANs募集。中性粒細胞向腫瘤的遷移主要由趨化因子配體與趨化因子受體1/2結合介導。趨化因子及其配體負責正常生理條件下中性粒細胞的募集，并參與TANs的活化，促進TANs的聚集[16]。在腫瘤荷瘤小鼠中，靶向趨化因子受體2介導的TANs活化增加了腫瘤浸潤淋巴細胞的數量，并增強抗程序性死亡檢查點1的阻斷[17]。腫瘤細胞分泌的趨化因子在TANs的募集中發揮重要作用，在胰腺癌小鼠中，CXC趨化因子受體2陽性TANs和CC趨化因子受體2陽性TAMs的雙重阻斷破壞了骨髓細胞的募集，提高了抗腫瘤免疫能力[18]。因而，阻斷趨化因子受體可能有助于提高機體的抗腫瘤能力。

1.3促進CRC轉移瘤血管的形成 轉移是腫瘤難以根治的重要原因，與腫瘤血管的形成密不可分，TANs和TAMs均具有促進腫瘤血管生成的潛力。在各種小鼠模型中，TAMs和TANs是基質金屬蛋白酶9的主要來源，通過降解細胞外基質促進血管生成[19]。而基質金屬蛋白酶9的表達僅在中性粒細胞中發現，故中性粒細胞耗竭可抑制原發腫瘤的血管生成。在腫瘤異種移植模型中，粒細胞集落刺激因子促進中性粒細胞在腫瘤的募集，使中性粒細胞的前動力蛋白-2表達上調，進而促進腫瘤血管生成，從而導致抗血管內皮生長因子治療的抗藥性[20]。在人體CRC肝轉移以及實驗性小鼠腸道腫瘤肝轉移模型中均發現，成纖維細胞生長因子2在中性粒細胞中表達，中和抗成纖維細胞生長因子2的抗體可導致中性粒細胞耗竭，進而減緩肝轉移灶的生長，降低血管密度，故在一定程度上耗竭TANs可減少腫瘤微血管的形成，減緩肝轉移瘤的生長[21]。因此，尋找腫瘤微環境中抑制血管生成的相關因子，對抑制腫瘤轉移、提高患者預后具有重要意義。

2 TANs在CRC中的價值

2.1TANs與CRC的預后 炎癥細胞浸潤在CRC患者的免疫反應中起重要作用，其促進了CRC的發生發展。中性粒細胞作為重要的炎癥細胞之一，在腫瘤微環境中通過形成網狀物、釋放活性氧類、分泌促腫瘤細胞因子、趨化因子以及免疫抑制等促進腫瘤發生。中性粒細胞是影響腫瘤患者生存的細胞群，對患者的預后有重要意義[22]。中性粒細胞聚集在癌癥患者特別是在晚期患者的外周血中，高循環中性粒細胞/淋巴細胞比值(neutrophil-lymphocyte ratio,NLR)是腫瘤患者臨床預后較差的生物標志物，NLR增高提示接受根治性手術治療的CRC患者生存率降低[23]。Dell′Aquila等[24]報道，NLR可作為不可切除的轉移性CRC患者應用貝伐單抗聯合化療預后不良的預測因子。因此，可通過測量NLR預測CRC患者的預后。NLR越高，患者接受化療藥物時的抵抗力越高，CRC患者的生存率越低[25]。

目前，關于TANs對CRC患者生存的影響存在爭議。Rao等[26]認為，腫瘤內中性粒細胞的增加與惡性表型相關，可預測CRC的不良預后。但Berry等[27]分析了CRC組織中中性粒細胞的數量認為，高水平的TANs與Ⅱ期CRC患者的總體生存改善有關。這可能與腫瘤微環境的信號影響中性粒細胞表型分化有關。文獻報道，腫瘤抑制基因Smad4的缺失通過趨化因子受體與配體軸將CC趨化因子受體1陽性髓細胞聚集到侵襲前部而促進原發性CRC進展，且CC趨化因子配體15在原發性和轉移性CRC中的表達是CRC患者預后的預測因子[28]。以上結果可能為趨化因子抑制劑在原發性CRC手術切除后作為輔助治療及預防CRC轉移提供依據。

2.2TANs與CRC肝轉移 CRC患者的死亡主要與肝、肺等重要器官轉移有關。肝轉移是一個復雜多步驟的過程，在腫瘤原發灶，轉化的腫瘤細胞通過分泌血管生成因子而產生廣泛的血管化，腫瘤細胞局部浸潤血管或淋巴管。大部分循環腫瘤細胞被血液流動的剪切力或宿主免疫系統破壞，僅少部分滯留于器官的毛細血管床中，腫瘤細胞外滲到器官實質并形成微轉移[29]。這種侵襲和種植轉移是肝轉移的關鍵步驟。通過脾注射接種腫瘤細胞的小鼠肝轉移模型證明了在肝內定植過程中TANs與CRC細胞間存在相互作用[30]。表達CRC細胞的小鼠招募表達CC趨化因子受體1陽性的髓樣細胞，在肝臟中形成早期轉移灶，TANs產生的基質金屬蛋白酶9有助于癌灶在早期的擴大，同時招募表達CC趨化因子受體1陽性的髓樣細胞也有助于原發性CRC的浸潤和肝、肺轉移，而幾乎所有的在轉移灶聚集的表達趨化因子配體的細胞均為TANs。敲除髓系細胞中CC趨化因子受體1可顯著抑制原發性和轉移的腫瘤生長[31]，表明CC趨化因子受體1抑制劑可能是治療CRC及其轉移的一種有前途的策略。

CRC轉移灶的形成與轉移部位血管的形成密不可分。CRC細胞分泌的趨化因子8與TANs表達的相關配體結合后在CRC的轉移中起重要作用。趨化因子8作為血管內皮生長因子的代償途徑維持腫瘤血管生成[32]。趨化因子配體8在腫瘤浸潤前表達上調，促進了CRC肝轉移，而短發夾RNA介導敲除趨化因子配體8基因可導致血管內皮生長因子A表達減少，顯著減少細胞的增殖、遷移和侵襲，同時也減少了腫瘤的體內轉移，提示趨化因子配體8的過表達可誘導血管內皮生長因子依賴的血管生成反應[33]。趨化因子配體8的表達可增加葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎中未成熟髓細胞的動員，加速急性炎癥和結腸癌的發生[34]。以上研究均提示，趨化因子配體8在CRC的浸潤和轉移中起促進作用。在趨化因子受體2相關基因敲除小鼠中，趨化因子受體-配體軸在宿主細胞中的缺失可抑制CRC生長和轉移[35]。此外，趨化因子受體1/2拮抗劑可通過減少腫瘤血管生成和促進腫瘤細胞凋亡抑制CRC的肝轉移[36]。聯合應用趨化因子受體2拮抗劑和奧沙利鉑可顯著減少腫瘤生長和血管生成[37]。總之，趨化因子配體的表達在促進腫瘤進展中發揮了積極作用，而相關配體的阻斷可能為CRC的治療提供新方向。

中性粒細胞胞外誘捕器可能與腫瘤相關血栓形成和腫瘤進展有關。中性粒細胞胞外誘捕器的核心結構是顆粒酶裝飾的去核染色質纖維，充當誘捕微生物的網，進而促進病原體與中性粒細胞衍生的效應分子之間的相互作用[38]。腫瘤生長本身誘導的缺氧狀態和分泌的集落刺激因子可促進中性粒細胞形成網狀物。對CRC小鼠肝轉移模型進行研究發現，網狀物通過加強建立轉移灶或促進現有微轉移灶生長，促進CRC生長，也有助于轉移灶形成過程中的遷移、侵襲和增殖，而利用DNA酶抑制中性粒細胞胞外誘捕器是一種具有潛在臨床應用前景的方法[39]。

其他信號分子也參與了中性粒細胞的促腫瘤作用。在人CRC肝轉移及小鼠肝轉移模型中均有中性粒細胞浸潤，在肝轉移灶中，TANs表達了促血管生成分子，表明腫瘤微環境中的中性粒細胞發生極化[21]。中和促血管生成分子可引起中性粒細胞消耗，并減少肝轉移微病灶的生長降低轉移灶的血管密度[40]。此外，肝臟本身的信號轉導途徑也調節TANs表型的分化，促進肝轉移。患有條件性肝特異性胰島素樣生長因子1缺乏癥的轉基因小鼠接種CRC細胞后3周，肝臟中浸潤的中性粒細胞雖然數量增加，但并未表現出促瘤表型特征[41]。表明肝臟中胰島素樣生長因子1對促進中性粒細胞向促腫瘤表型分化有積極影響，持續的胰島素樣生長因子1缺乏可能是改變中性粒細胞表型的必要條件。與之類似，在肝臟中高表達的組織金屬蛋白酶抑制劑1可導致肝臟趨化因子配體12水平升高，促進中性粒細胞向肝臟募集，從而促進肝轉移的發生[42]。因此，抑制趨化因子配體12依賴性中性粒細胞募集和中性粒細胞全身耗竭均能抑制組織金屬蛋白酶抑制劑1誘導的肝轉移易感性[43]。

3 TANs作為腫瘤治療的潛在目標

雖然TANs及其產生的細胞因子在CRC的發生發展中起重要作用，但具體機制尚不完全清楚，TANs作為潛在治療靶點的評估仍在進行中。考慮到TANs在腫瘤發展中的作用，靶向中性粒細胞可能成為一種潛在的新的抗腫瘤方法。一些“耗竭”循環中性粒細胞的化療手段，雖然減少了腫瘤微環境中的中性粒細胞,但也會增加機會性感染的發生率。而阻斷中性粒細胞，特別是TANs的特定群體，可促進腫瘤消退或減少轉移擴散。

轉化生長因子-β作為腫瘤微環境的組分之一，可調節中性粒細胞的促腫瘤和抗腫瘤表型，因此轉化生長因子-β阻斷在理論上是一種潛在的治療策略。然而，由于轉化生長因子-β參與了許多生理過程，導致測試轉化生長因子-β阻斷作用的試驗因顯著的不良反應而失敗[44]。針對轉化生長因子-β或其受體的新策略目前正在臨床試驗中。

中性粒細胞是最豐富的白細胞，在免疫應答期間被招募到感染部位，中性粒細胞顆粒中的酶可使吞噬溶酶體的pH值發生變化，并通過呼吸爆發釋放活性氧類進而殺滅病原體[45]。然而，中性粒細胞釋放的活性氧類可導致DNA堿基損傷以及突變，這些突變對細胞癌變、細胞增殖、癌性炎癥、免疫抑制等至關重要，如過氧化氫之類的活性氧類也可以作為細胞信號轉導的信使，調節細胞信號通路(如促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信號調節激酶1/2通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B、核因子κB通路)在腫瘤中的作用，TANs還可通過生成過氧化氫抑制肺轉移[46]。癌癥的進展需要腫瘤微環境中活性氧類達到一定水平[47]。中性粒細胞釋放活性氧類可被認為是腫瘤患者潛在的治療靶點。

趨化因子阻斷可能是抑制中性粒細胞向腫瘤募集的另一有效策略。CRC細胞分泌的趨化因子8會招募中性粒細胞[33-34,37]，通過中和抗體阻斷趨化因子8受體-配體軸可能是一種很好的治療方法。然而，這種方法對人類腫瘤循環或腫瘤內中性粒細胞表型的影響尚不清楚。因此，需要進一步研究以獲得對TANs和CRC的詳細了解，以利于未來新的抗腫瘤治療的應用。

4 小 結

中性粒細胞作為人體循環免疫中最豐富的白細胞，在機體免疫、防御等方面占重要地位。但癌癥患者術后循環NLR增高可對患者產生不良影響。在CRC患者中，浸潤CRC組織的TANs受周圍組織信號影響，表現出抗腫瘤性N1表型或促腫瘤性N2表型的可塑性，分化為促進腫瘤表型可對CRC患者的遠期生存產生不利影響。對中性粒細胞的研究有助于了解腫瘤微環境，尋找調節中性粒細胞分化的相關細胞因子，了解細胞因子在不同通路的作用，進而尋找抑制腫瘤發生發展的方法及藥物。因此，對中性粒細胞的研究有助于尋找新的特異性治療靶點和生物標志物。