外周血Treg細胞與IDO檢測對慢性乙型肝炎病毒感染者罹患原發性肝癌的預測價值

蔡溪巍，孫世忠，王秋野，王沈峰

(1.遼寧省金秋醫院檢驗科，沈陽 110016； 2.遼寧中醫藥大學附屬第二醫院檢驗科，沈陽 110034)

原發性肝癌(primary liver cancer，PLC)是臨床常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度極高，為癌癥致死的主要原因之一，且乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染為PLC的首要致病因素。流行病學研究顯示，HBV感染的患者最終發展為肝癌的風險是未感染者的5～10倍[1-2]。臨床研究證實，隨著HBV感染治療手段的不斷提高，PLC的發生風險雖得到了顯著抑制，但尚不能完全消除，PLC治療手段的提高雖然改善了患者的生命質量，但5年生存率并未明顯提高[3]。因此，早期篩查并診斷PLC仍是最有可能延長患者生存時間的有效手段。然而，目前常用的血清甲胎蛋白、腹部超聲檢測等篩查手段準確率及敏感性并不理想，探尋新的PLC預測方法迫在眉睫。研究發現，抗腫瘤免疫應答缺陷是HBV感染患者發展為肝癌的主要作用機制之一，且具有免疫調節功能的調節性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)可能與腫瘤免疫逃逸密切相關，參與惡性腫瘤的發生及發展[4-5]。王星月等[6]的研究顯示，PLC患者Treg細胞、IDO水平均較HBV感染者及健康人群明顯升高；程源[7]的研究顯示，Treg細胞、IDO與HBV感染發展為肝癌密切相關。但有關Treg細胞與IDO檢測對慢性HBV感染者罹患PLC預測價值的報道較少。本研究旨在分析外周血Treg細胞與IDO檢測對慢性HBV感染者罹患PLC的預測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2019年12月遼寧省金秋醫院收治的188例慢性HBV感染者作為研究對象，其中84例單純慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者作為CHB組，104例合并PLC患者作為PLC組，選取同期60名健康體檢者作為對照組。其中，CHB組男45例、女39例，年齡27～67歲，平均(42±15)歲；PLC組男59例、女45例，年齡22～74歲，平均(43±15)歲；對照組男33名、女27名，年齡26～71歲，平均(43±15)歲。三組受試者的性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經遼寧省金秋醫院醫學倫理委員會批準，受試者均簽署了知情同意書。

1.2納入與排除標準 納入標準：①CHB患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]中CHB的診斷標準，乙型肝炎表面抗原和(或)HBV DNA陽性，且持續時間在6個月以上，伴有肝功能異常及丙氨酸轉氨酶>38 IU/L；②PLC患者符合《原發性肝癌診療規范(2017年版)》[9]中PLC的診斷標準，乙型肝炎表面抗原陽性且甲胎蛋白≥400 μg/L；③年齡18～75歲。排除標準：①合并心、肺、腎等重要臟器功能障礙；②合并惡性腫瘤、脂肪肝、卵巢囊腫等可影響本研究結果的疾病；③合并藥物性肝炎、酒精性肝病、其他類型病毒性肝炎、自身免疫性肝病；④處于月經期、妊娠期或哺乳期女性。

1.3主要試劑與儀器 鼠抗人單克隆抗體CD4-CP(批號：P0116057)、CD25-PE(批號：P0140484)、CD127-FITC(批號：P011537)購自北京靈寶科技有限公司生產；流式細胞儀(型號：EPICS XL)由美國Beckman Instruments公司生產；高速離心機(型號：Allegra 21R)由美國Beckman公司生產；Trizol試劑(批號：17694-031)、反轉錄試劑盒(批號：RR047A)、實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒(批號：RR420A)購自日本TaKaRa公司；引物設計及合成由生工生物工程(上海)股份有限公司生產。

1.4檢測方法

1.4.1Treg細胞 抽取各組受試者晨起空腹靜脈血3 mL，在100 μL抗凝全血中加入5 μL鼠抗人單克隆抗體(CD4-CP、CD25-PE、CD127-FITC)混勻，室溫下避光孵育15 min；加入1 mL溶血素混勻，室溫下避光作用12 min；以離心半徑15 cm、1 500 r/min離心5 min，棄上清后，加入2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)；離心半徑15 cm、1 500 r/min離心5 min，棄上清后，再次加入300 μL PBS重懸細胞；采用流式細胞儀檢測Treg細胞水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，并用Flowjo軟件分析處理。

1.4.2IDO 信使RNA(messenger RNA，mRNA) 抽取各組受試者晨起空腹靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管內，加入淋巴細胞分離液(Ficoll-Paque)22 ℃、離心半徑10 cm、3 300 r/min密度梯度離心20 min，獲取外周血單個核細胞；離心半徑15 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌后，加入Trizol至細胞全部裂解后靜置5 min，加入Trizol及氯仿作用5 min；4 ℃、離心半徑10 cm、12 000 r/min離心15 min，取上層mRNA，加入Trizol及異丙醇作用10 min；4 ℃、離心半徑10 cm、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇洗滌；4 ℃、離心半徑10 cm、9 000 r/min離心10 min，棄上清，吹干；加入二乙基焦碳酸酯水溶解、重懸后，60 ℃作用10 min，獲取總mRNA(A260/A280值為1.8～2.0視為mRNA提取合格)；按照實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒說明書反轉錄合成互補DNA，內參采用β-Actin，結果使用公式F=2-△△Ct轉換，IDO引物序列：上游5′-TTAATGTAACCCAACAAGAG-3′，下游5′-GTATTAGTTTGTGGCTCTGT-3′；β-Actin引物序列：上游5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游5′-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3′。

2 結 果

2.1三組受試者外周血Treg細胞及IDO mRNA水平比較 三組受試者外周血Treg細胞及IDO mRNA水平

比較差異有統計學意義(P<0.01)，CHB組和PLC組外周血Treg細胞及IDO mRNA水平均顯著高于對照組，且PLC組高于CHB組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 三組受試者外周血Treg細胞及IDO mRNA水平比較

2.2外周血Treg細胞及IDO mRNA水平與HBV感染嚴重程度的相關性分析 Spearman相關分析結果顯示，外周血Treg細胞及IDO mRNA水平與HBV感染嚴重程度呈正相關(r=0.397、r=0.425，均P<0.001)。

2.3外周血Treg細胞及IDO mRNA在CHB患者罹患PLC中的預測價值分析 外周血Treg細胞預測CHB患者罹患PLC的AUC為0.815(95%CI0.703～0.928)，臨界值為9.31%時，靈敏度為86.5%，特異度為72.2%；外周血IDO mRNA預測CHB患者罹患PLC的AUC為0.818(95%CI0.703～0.934)，臨界值為2.38時，靈敏度為87.4%，特異度為71.3%。見圖2。

3 討 論

HBV感染是我國主要的病毒感染類型，據不完全統計顯示，我國HBV攜帶者約1.2億[10]。臨床研究證實，HBV感染是引發PLC的獨立危險因素，患者感染HBV后易逐漸發展為PLC，且大部分PLC患者發現時已進展為中晚期[11]。因此，尋找一種較為理想的PLC早期篩查方法，對改善患者預后、延長患者生存期具有重要意義。近年來有研究提出，抗腫瘤免疫應答缺陷與HBV感染患者發展為肝癌的主要作用機制密切相關，且證實Treg細胞具有免疫抑制與免疫無能兩種免疫特性，可抑制自身T淋巴細胞的增殖，參與自身腫瘤細胞的免疫逃逸[12]；具有免疫調節功能的IDO可通過抑制自然殺傷細胞及T細胞活性而阻斷免疫反應過程，以利于惡性腫瘤組織細胞的分裂、增殖[13-14]。楊峻等[15]通過觀察HBV感染肝癌患者外周血Treg細胞和IDO的表達發現，PLC患者的Treg細胞、IDO均呈高表達。

CHB：慢性乙型肝炎；PLC：原發性肝癌；Treg：調節性T細胞圖1 對照組(1a)、CHB組(1b)、PLC組(1c)外周血Treg細胞流式圖

Treg：調節性T細胞；IDO：吲哚胺2，3-雙加氧酶；CHB：慢性乙型肝炎；PLC：原發性肝癌；ROC：受試者工作特征曲線圖2 外周血Treg及IDO預測CHB罹患PLC的ROC曲線

肝癌在發生發展過程中可逃避機體免疫監視，致使腫瘤細胞免于被宿主的自身免疫系統清除。Treg細胞為特殊的T細胞亞群，可調控自身免疫反應，參與機體對感染性疾病、腫瘤等免疫耐受過程，不僅可分泌轉化生長因子-β、白細胞介素-10、白細胞介素-12等細胞因子，進而抑制效應細胞的抗腫瘤免疫功能，還可以半乳糖凝集素為媒介與T細胞表面的糖蛋白受體發生反應而抑制T細胞分泌γ干擾素[16-17]。IDO為色氨酸-犬尿氨酸代謝途徑中的限速酶，表達于具有調節免疫反應的細胞質內，在機體免疫抑制中具有重要調節功能，可通過分解代謝色氨酸而抑制T細胞的免疫功能。IDO水平升高可導致細胞微環境中的色氨酸消耗量增大直至耗竭，致使機體處于色氨酸饑餓狀態，尤其是對病原微生物、迅速分裂期細胞中的色氨酸剝脫效應明顯[18]。而當色氨酸濃度較低時，T細胞分化靜止在G1期，其增殖被抑制，處于靜息狀態的T細胞較正常T細胞更易凋亡造成T細胞缺乏，進而使機體形成免疫豁免區，使腫瘤細胞免遭機體免疫系統的攻擊[19]。部分學者認為，IDO水平升高導致局部微環境色氨酸耗竭而引發的T細胞強效免疫抑制可能是肝癌發生發展過程中形成免疫耐受，肝癌細胞逃避機體免疫攻擊的關鍵[20-21]。本研究結果顯示，CHB組和PLC組的外周血Treg細胞及IDO mRNA水平均顯著高于對照組，且PLC組高于CHB組(P<0.05)，說明HBV感染早期病毒可通過上調IDO水平而抑制機體免疫反應，協助病毒在機體內持續存在，并形成惡性循環，最終利于PLC細胞的免疫逃逸，促使其向PLC發生發展。HBV感染后，機體啟動細胞免疫抵御病毒感染，如T淋巴細胞可啟動非溶細胞或溶細胞機制清除病毒控制感染。然而，一旦感染者對HBV的細胞免疫應答反應不足，即會表現為免疫耐受，致使機體免疫功能降低[22]。本研究通過ROC曲線分析顯示，外周血Treg細胞及IDO mRNA預測慢性HBV感染者罹患PLC的靈敏度分別為86.5%、87.4%，特異度分別為72.2%、71.3%，與苗海霞等[23]的研究結果基本一致。

綜上所述，外周血Treg細胞、IDO mRNA檢測在預測慢性HBV感染者罹患PLC中具有較高的靈敏度及特異度，應用價值較高。通過生物醫學手段下調慢性HBV感染者體內的Treg細胞及IDO水平，可能重建患者的主動免疫功能，從而抑制腫瘤的發生及發展。