阿帕替尼聯(lián)合多西紫杉醇對(duì)卵巢癌干細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制

甘蕾，黃雅可，黃燕，謝榮凱

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400037)

卵巢癌作為目前致死率較高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，具有起病隱匿、進(jìn)展快速等特點(diǎn)。目前，提高卵巢癌患者生存率的方式仍以盡早發(fā)現(xiàn)、盡早手術(shù)切除并輔以化療為主[1]。但相關(guān)研究顯示，化療藥物可導(dǎo)致難以耐受的不良反應(yīng)及化療過程中產(chǎn)生的耐藥性，疾病治愈率較低、復(fù)發(fā)率較高，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2-3]。阿帕替尼是抗腫瘤血管生成的靶向治療藥物，多西紫杉醇是新一代紫杉類化合物抗腫瘤藥物，兩者目前已被用于乳腺癌、肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的臨床治療，效果良好[4-6]，部分學(xué)者將其應(yīng)用于卵巢癌的治療，并取得了一定的臨床療效[7-8]，但具體作用機(jī)制尚不明確。近年來，隨著卵巢癌發(fā)生、發(fā)展研究的不斷深入，部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)，占卵巢癌發(fā)病率80%～90%的上皮來源卵巢癌是一種干細(xì)胞相關(guān)性腫瘤，其中分離中的卵巢癌干細(xì)胞與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、耐藥等密切相關(guān)[9-11]。而對(duì)卵巢癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性、相關(guān)信號(hào)通路、靶向定位等的深入研究為此類患者的臨床治療提供了更多有價(jià)值的理論依據(jù)[12-13]。本研究主要分析阿帕替尼聯(lián)合多西紫杉醇對(duì)卵巢癌干細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制，以期為卵巢癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細(xì)胞(SKOV3)株由陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；阿帕替尼(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：180102KC，二甲基亞砜溶解后使用)、多西紫杉醇(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：180406AF，二甲基亞砜溶解后使用)；重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(美國Pepro Tech公司生產(chǎn)，批號(hào)：AF-100-18B)、重組人表皮生長因子(美國Pepro Tech公司生產(chǎn)，批號(hào)：AF-100-15)；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司生產(chǎn)，批號(hào)：SH300023)；胎牛血清(批號(hào)：11011-6123)、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、 Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒、RIPA蛋白裂解液(美國Gibco公司生產(chǎn))；兔Oct-4單抗、兔CD133單抗、兔Nanog單抗、兔上皮鈣黏素(E-cadhefin)單抗、兔波形蛋白(Vimentin)單抗、兔扭曲蛋白(Twist)單抗、兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單抗(英國Abcam公司生產(chǎn))；流式凋亡檢測(cè)試劑盒、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司生產(chǎn))；引物設(shè)計(jì)及合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；4 ℃低溫高速離心機(jī)(德國Beckman公司)；酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1SKOV3細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代 ①用紫外線照射超凈工作臺(tái)臺(tái)面30 min 后，迅速取出液氮中的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞凍存管，并置于37 ℃恒溫水浴箱中快速解凍；②待其完全融解后用移液器吹打細(xì)胞液使細(xì)胞分散，并將細(xì)胞液置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)混勻，放在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；③待細(xì)胞貼壁生長良好、融合度達(dá)80%左右時(shí)，去除培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶潤洗，再次加入適量胰蛋白酶，待光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞折光性增強(qiáng)且出現(xiàn)明顯細(xì)胞間隙時(shí)吸去胰蛋白酶，加入10%胎牛血清終止胰蛋白酶消化；④吸管吹打液體至細(xì)胞形成懸液后，以離心半徑10 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)混勻；⑤計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，以2×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度分別接種于新的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天更換1次培養(yǎng)基，行傳代培養(yǎng)。

1.2.2卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代 ①取對(duì)數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)液1 d后，按1.2.1所述方式進(jìn)行細(xì)胞消化制備細(xì)胞懸液，以離心半徑10 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，將細(xì)胞懸于無血清培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基+重組人表皮生長因子20 ng/mL+重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子10 ng/mL+胰島素5 μg/mL配置而成)中；②計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，以2×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度分別接種于新的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天補(bǔ)充0.25 mL無血清培養(yǎng)基；③7～10 d后收集懸浮球細(xì)胞，以離心半徑10 cm，800 r/min離心2 min，棄上清，機(jī)械吹打，PBS洗滌1次，將細(xì)胞懸液重懸于無血清培養(yǎng)基中；④計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，以2×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度分別接種于新的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，隔天補(bǔ)充0.25 mL無血清培養(yǎng)基；⑤6～8 d后，進(jìn)行1∶2傳代擴(kuò)增培養(yǎng)；⑥培養(yǎng)7 d后取干細(xì)胞樣細(xì)胞，PBS洗滌2次后，在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行消化(同1.2.1)，并重新接種于無血清培養(yǎng)基中。

1.3卵巢癌干細(xì)胞的鑒定 qRT-PCR法檢測(cè)卵巢癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因Oct-4、CD133及Nanog的表達(dá)。具體步驟如下：①取SKOV3貼壁細(xì)胞及傳代培養(yǎng)至第7代的SKOV3干細(xì)胞樣細(xì)胞，以離心半徑10 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌1次，加入Trizol，移液槍吹打至細(xì)胞全部裂解后靜置5 min，加入Trizol及氯仿作用5 min；② 4 ℃、離心半徑10 cm、12 000 r/min離心15 min，取上層信使RNA(messenger RNA，mRNA)，加入Trizol及異丙醇靜置10 min；③ 4 ℃、離心半徑10 cm、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇洗滌；④ 4 ℃、離心半徑10 cm、9 000 r/min離心10 min，棄上清，吹干；⑤加焦碳酸二乙酯水溶解、重懸后，60 ℃作用10 min；⑥取少量mRNA，檢測(cè)其在260 nm及280 nm波長的光密度(optical density，OD)值，若A260/A280值為1.8～2.0視為mRNA提取合格；⑦按照qRT-PCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA，內(nèi)參采用GAPDH，結(jié)果使用公式F=2-ΔΔCt轉(zhuǎn)換。Oct-4引物序列為F：GGCCCGAAAGAGAAAGCGAACC，R：ACCCAGCAG-CCTCAAAATCCTCTC；CD133引物序列為F：TGGA-TGCAGAACTTGACAACGT，R：ATACCTGCTACGACAGTCGTGGT；Nanog引物序列為F：TTCCTTCCTCCATGGATCTC，R：TCTGCTGGAGGCTGAGGTAT；GAPDH引物序列為F：CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT，R：AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4四甲基偶氮唑鹽比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將第7代SKOV3干細(xì)胞樣細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化重新形成單細(xì)胞懸液后分為對(duì)照組、5 μg/mL組、10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組、80 μg/mL組，將細(xì)胞濃度為6×104個(gè)/mL的干細(xì)胞分別接種于96孔板中(每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔)培養(yǎng)24 h；對(duì)照組僅加入無血清培養(yǎng)基，其他各組分別加入相應(yīng)濃度的阿帕替尼后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h；培養(yǎng)后，每孔加20 μL MTT孵育4 h，棄培養(yǎng)基后每孔加150 μL二甲基亞砜。最后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(450 nm)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50，經(jīng)計(jì)算為58.98 μg/mL，后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度取整數(shù)值60 μg/mL)，增殖抑制率(%)=(1-藥物作用組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將第7代SKOV3干細(xì)胞樣細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化重新形成單細(xì)胞懸液后分為對(duì)照組、阿帕替尼組、多西紫杉醇組與聯(lián)合組，將細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL的干細(xì)胞分別接種于96孔板中(每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔)，對(duì)照組僅加入無血清培養(yǎng)基，阿帕替尼組加入無血清培養(yǎng)基和阿帕替尼(60 μg/mL)，多西紫杉醇組加入無血清培養(yǎng)基和多西紫杉醇(60 μg/mL)，聯(lián)合組加入無血清培養(yǎng)基、阿帕替尼(60 μg/mL)和多西紫杉醇(60 μg/mL)，作用48 h后，以離心半徑10 cm、2 000 r/min離心5 min，胰蛋白酶消化后，以2 000 r/min、離心半徑10 cm離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，以離心半徑10 cm、2 000 r/min離心5 min，棄上清。按照流式磷脂結(jié)合蛋白V-熒光基團(tuán)異硫氰酸熒光素/碘化丙啶雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)，F(xiàn)lowjo軟件分析處理。

1.6Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲遷移情況 4組干細(xì)胞同1.5所述方式加入培養(yǎng)基及藥物作用48 h后，每個(gè)Transwell小室的上室加入200 μL各組細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度均為25×104個(gè)/mL)，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(侵襲實(shí)驗(yàn)還需預(yù)先在小室內(nèi)鋪Matrigel基質(zhì)膠)；將Transwell小室放入24孔板中，置入37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中遷移實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)16 h，侵襲實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)48 h；取出Transwell，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦去內(nèi)層未遷移細(xì)胞，將小室倒置于載玻片上，于正置顯微鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)(每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔，觀察4個(gè)視野，即20個(gè)復(fù)孔的情況)。

1.7qRT-PCR法檢測(cè)E-cadhefin、Vimentin及Twist mRNA的表達(dá)水平 4組干細(xì)胞按1.5所述方式加入培養(yǎng)基及藥物作用48 h后，Trizol法提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA、檢測(cè)E-cadhefin、Vimentin及Twist mRNA表達(dá)水平(方法同1.3)。E-cadhefin引物序列為F：CTGGACGCTCGGGCCTGAAGT，R：GGGTCAGTATCAGCCGCTTT；Vimentin引物序列為F：ACAGGCTTTAGCGAGTTATT，R：GGGCTCCTAGCGGTTTAG；Twist引物序列為F：TGTCCGCGTCCCACTAGC，R：TG-TCCATTTTCTCCTTCTCTGGA。

1.8Western blotting法檢測(cè)E-cadhefin、Vimentin及Twist蛋白的表達(dá)水平 4組干細(xì)胞同1.5所述方式加入培養(yǎng)基及藥物作用48 h后，加入細(xì)胞裂解液冰浴15 min，以離心半徑10 cm、12 000 r/min離心15 min后，提取總蛋白，并采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取蛋白上樣行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后，分別加入GAPDH、E-cadherin、Vimentin、Twist一抗4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，加入二抗，室溫孵育60 min；PBS洗滌3次，電化學(xué)發(fā)光顯影；最后用Image J圖像分析軟件檢測(cè)蛋白條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌干細(xì)胞的鑒定 SKOV3干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因Oct-4、CD133及Nanog的表達(dá)水平顯著高于卵巢癌SKOV3貼壁細(xì)胞(P<0.05)，見表1。

表1 SKOV3干細(xì)胞與SKOV3貼壁細(xì)胞Oct-4、CD133及Nanog mRNA表達(dá)水平比較

2.2不同濃度阿帕替尼對(duì)卵巢癌干細(xì)胞的增殖抑制率比較 阿帕替尼濃度處于5～80 μg/mL時(shí)，隨著阿帕替尼濃度的增加，卵巢癌干細(xì)胞增殖抑制率明顯增高(P<0.01)，見表2，IC50值為58.98 μg/mL。

表2 不同濃度阿帕替尼對(duì)卵巢癌干細(xì)胞的增殖抑制率比較 (n=5)

2.3阿帕替尼及多西紫杉醇對(duì)卵巢癌干細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組、阿帕替尼組、多西紫杉醇組、聯(lián)合組流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的卵巢癌干細(xì)胞凋亡率分別為(5.58±1.55)%、(21.97±2.21)%、(21.70±2.26)%、(59.56±3.68)%，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=404.100，P<0.001)，與對(duì)照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組卵巢癌干細(xì)胞凋亡率均明顯升高(P<0.05)，其中聯(lián)合組的卵巢癌干細(xì)胞凋亡率最高，見圖1。

2.4阿帕替尼及多西紫杉醇對(duì)卵巢癌干細(xì)胞侵襲、遷移的影響 4組卵巢癌干細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與對(duì)照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組卵巢癌干細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)，且聯(lián)合組卵巢癌干細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)少于阿帕替尼組和多西紫杉醇組(P<0.05)，見表3。

2.5阿帕替尼及多西紫杉醇對(duì)卵巢癌干細(xì)胞E-cadhefin、Vimentin及Twist mRNA表達(dá)的影響 各組卵巢癌干細(xì)胞E-cadhefin、Vimentin及Twist mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與對(duì)照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組卵巢癌干細(xì)胞E-cadhefin mRNA表達(dá)水平均顯著升高，聯(lián)合組高于阿帕替尼組、多西紫杉醇組(P<0.05)；與對(duì)照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組卵巢癌干細(xì)胞Vimentin及Twist mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合組低于阿帕替尼組、多西紫杉醇組(P<0.05)。見表4。

2.6阿帕替尼及多西紫杉醇對(duì)卵巢癌干細(xì)胞E-cadhefin、Vimentin及Twist蛋白表達(dá)的影響 各組卵巢癌干細(xì)胞E-cadhefin、Vimentin及Twist蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與對(duì)照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組卵巢癌干細(xì)胞E-cadhefin蛋白表達(dá)水平均顯著升高，聯(lián)合組高于阿帕替尼組、多西紫杉醇組(P<0.05)；與對(duì)照組比較，阿帕替尼組、多西紫杉醇組及聯(lián)合組Vimention和Twist蛋白水平均降低，聯(lián)合組低于阿帕替尼組、多西紫杉醇組(P<0.05)，見表5、圖2。

FITC：異硫氰酸熒光素；PI：碘化丙啶；對(duì)照組：僅加入無血清培養(yǎng)基；聯(lián)合組：加入無血清培養(yǎng)基、阿帕替尼、多西紫杉醇圖1 對(duì)照組(1a)、阿帕替尼組(1b)、多西紫杉醇組(1c)、聯(lián)合組(1d)卵巢癌干細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞圖

表3 各組卵巢癌干細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)比較 (n=20，個(gè)，

表4 各組卵巢癌干細(xì)胞E-cadhefin、Vimentin及Twist mRNA表達(dá)水平比較

表5 各組卵巢癌干細(xì)胞E-cadhefin、Vimentin及Twist蛋白表達(dá)水平比較

E-cadhefin：上皮鈣黏素；Vimentin：波形蛋白；Twist：扭曲蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶圖2 各組卵巢癌干細(xì)胞E-cadhefin、Vimentin及Twist蛋白表達(dá)條帶圖

3 討 論

卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)致死率較高的惡性腫瘤，由于發(fā)病隱匿且缺乏有效的早期篩查手段，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。阿帕替尼作為一種特異性靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2的小分子血管生成抑制劑，能夠高選擇性地結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體2胞內(nèi)酪氨酸ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，阻止腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長[14]。多西紫杉醇是新一代紫杉類抗腫瘤藥物，可通過加強(qiáng)微管蛋白聚合、抑制微管解聚破壞腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，將腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，從而抑制腫瘤生長[15]，兩者對(duì)卵巢癌的治療均有一定的作用，但具體作用機(jī)制尚不完全明確。

卵巢癌干細(xì)胞作為腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源，對(duì)卵巢癌高致死率、高復(fù)發(fā)率、高耐藥性等的研究具有重要意義。作為全能性或多能性干細(xì)胞標(biāo)志物，Oct4在保持胚胎干細(xì)胞自我更新及全能性方面具有重要作用[16]；CD133為多種組織腫瘤干細(xì)胞表面獨(dú)立表達(dá)的特異性標(biāo)記分子，可通過其表達(dá)水平分選干細(xì)胞、前體細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞[17]；Nanog是公認(rèn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志性基因，去除或使該基因失活能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[16]。本研究中，通過分離獲取的卵巢癌干細(xì)胞的Oct-4、CD133及Nanog mRNA的表達(dá)水平均明顯高于卵巢癌SKOV3貼壁細(xì)胞，可見獲取的卵巢癌干細(xì)胞質(zhì)量較佳，為后續(xù)的增殖、凋亡、侵襲遷移等實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。經(jīng)增殖、凋亡、侵襲遷移等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼為5～80 μg/mL時(shí)，隨著阿帕替尼濃度的增加，其對(duì)卵巢癌干細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強(qiáng)；與單純用藥相比，阿帕替尼與多西紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用可顯著促進(jìn)卵巢癌干細(xì)胞的凋亡，抑制卵巢癌干細(xì)胞的侵襲及遷移。由此推測(cè)，增加卵巢癌干細(xì)胞的凋亡率可能是兩藥聯(lián)合應(yīng)用協(xié)同抗癌的主要原因之一。

E-cadhefin作為一種鈣離子依賴的細(xì)胞黏附分子，不僅可參與細(xì)胞形態(tài)的維持，還可介導(dǎo)細(xì)胞間的同源性黏附，其表達(dá)水平下調(diào)會(huì)降低同源細(xì)胞間的黏附力，有利于腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位向細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)散[18-19]。Vimentin作為一種細(xì)胞骨架蛋白，可與胞質(zhì)中的整合素和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1結(jié)合，下調(diào)細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供有利條件[20-21]。Twist作為一種常染色體的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，能夠抑制E-cadhefin mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而改變細(xì)胞形態(tài)，降低細(xì)胞黏附性，并能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，增加腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力[22-23]。E-cadhefin、Vimentin、Twist均為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志物，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的重要過程，即極性上皮細(xì)胞在部分因素作用下轉(zhuǎn)變成為運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)的間葉性表皮細(xì)胞是上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的部分機(jī)制[24]。本研究結(jié)果顯示，阿帕替尼與多西紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用組細(xì)胞內(nèi)E-cadhefin的表達(dá)水平明顯升高，而Vimentin及Twist的表達(dá)水平明顯降低，推測(cè)E-cadhefin水平上調(diào)、Vimentin及Twist水平下調(diào)可能是阿帕替尼與多西紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用抑制卵巢癌干細(xì)胞侵襲及遷移的部分分子生物學(xué)作用機(jī)制，即阿帕替尼與多西紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用可能干預(yù)卵巢癌干細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而抑制卵巢癌干細(xì)胞的侵襲及遷移，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，阿帕替尼聯(lián)合多西紫杉醇可顯著抑制卵巢癌干細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，并能促進(jìn)卵巢癌干細(xì)胞的凋亡。