新型蛇葡萄素衍生物γ-聚谷氨酸蛇葡萄素酯的合成、表征及抗腫瘤作用評價

吳曉珊 倪峰 高毓瀅 黃仁杰

摘 要 目的：設計合成γ-聚谷氨酸蛇葡萄素酯（γ-PGA-AMP），并進行表征和體外抗腫瘤活性評價。方法：利用酯化反應將蛇葡萄素接載在γ-聚谷氨酸上生成合成產(chǎn)物。采用紫外光譜法、傅里葉紅外光譜法、氫-1核磁共振法及元素分析等方法對合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行表征;采用紫外吸收光譜法在293 nm波長處測定合成產(chǎn)物中蛇葡萄素的含量。以5-氟尿嘧啶為陽性對照，采用MTT法檢測γ-PGA-AMP、蛇葡萄素對人乳腺癌細胞MCF-7、人肝癌細胞HepG2、人肺癌細胞A549的抑制作用，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。結(jié)果：表征結(jié)果顯示，蛇葡萄素的7位游離羥基與γ-聚谷氨酸a位碳上的羧基已發(fā)生了酯化反應，合成產(chǎn)物即為γ-PGA-AMP（產(chǎn)率為55.7%），其中蛇葡萄素含量為32.3%。γ-PGA-AMP和蛇葡萄素對MCF-7、HepG2和A549細胞均有明顯的抑制作用;γ-PGA-AMP對上述3種腫瘤細胞的IC50分別為40.19、28.29、55.23 μg/mL，蛇葡萄素的IC50分別為105.30、81.23、130.10 μg/mL，5-FU的IC50分別為24.72、87.98、30.99 μg/mL。結(jié)論：成功合成具有體外抗腫瘤活性的γ-PGA-AMP，且抗腫瘤活性強于蛇葡萄素。

關鍵詞 蛇葡萄素;γ-聚谷氨酸;高分子化合物;合成;表征;抗腫瘤作用

中圖分類號 R284.3;R979.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）22-2720-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.22.06

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To design and synthesize poly （γ-glutamic acid）-ampelopsin （γ-PGA-AMP）， and to characterize it and evaluate its anti-tumor activity in vitro. METHODS： Synthetic product was produced through an esterification reaction between γ-PGA and ampelopsin. The structure of synthetic product was characterized by the UV spectrophotometry， Fourier transform infrared （FT-IR） spectroscopy，1H-NMR spectra and the quantitative elemental analysis. The content of ampelopsin in synthetic product was determined by UV absorption spectrometry at 292 nm. Using 5-FU as positive control， MTT assay was used to determine inhibitory effects of γ-PGA-AMP and ampelopsin on human breast cancer cell MCF-7， human liver cancer cell HepG2 and human lung cancer cell A549. The IC50 was calculated. RESULTS： The results showed that the free 7-hydroxyl group of ampelopsin and the a-carboxyl group of γ-polyglutamic acid had been esterified to obtain γ-PGA-AMP; the yield of γ-PGA-AMP was 55.7%， and the content of ampelopsin was 32.3%. The inhibitory effect of γ-PGA-AMP and ampelopsin on MCF-7， HepG2 and A549 cells was obvious. IC50 of γ-PGA-AMP （to 3 above tumor cells） were 40.19， 28.29 and 55.23 μg/mL， those of ampelopsin were 105.30， 81.23， 130.10 μg/mL， those of 5-FU were 24.72， 87.98， 30.99 μg/mL， respectively. CONCLUSIONS： γ-PGA-AMP with anti-tumor effect in vitro is synthesized successfully， and its anti-tumor effect is stronger than that of ampelopsin.

KEYWORDS? ?Ampelopsin; Poly （γ-glutamic acid）; Polymer compounds; Synthesis; Characterization; Anti-tumor effect

蛇葡萄素的化學名為3，5，7，3′，4′，5′-六羥基-2，3-二氫黃酮，分子式為C15H12O8，又名二氫楊梅素、雙氫楊梅樹皮素、福建茶素等，是一種多酚羥基雙氫黃酮醇，屬黃酮類化合物[1-2]，主要存在于大葉蛇葡萄[3]、藤茶[4]等多種植物中。蛇葡萄素的毒性低，具有抗氧化、鎮(zhèn)痛、止咳、抑菌、保肝護肝、改善肝纖維化、降血糖、降血脂、增強免疫力、抗腫瘤等多種藥理活性[5-7]。目前，蛇葡萄素的研究熱點在其抗腫瘤活性上，但是在研究過程中，有學者發(fā)現(xiàn)該化合物的體內(nèi)抗癌效果并不理想，分析原因可能與該化合物溶解性和穩(wěn)定性較差，同時存在較多的作用靶點，選擇性不強、藥理效應較弱等不足有關[8-9]。針對上述不足，本課題組擬選用高分子聚合物γ-聚谷氨酸對蛇葡萄素進行結(jié)構(gòu)修飾。γ-聚谷氨酸是一種天然高分子聚合物，是由谷氨酸重復單元通過α-氨基與γ-羧基之間的酰胺鍵連接而成，是一種可生物降解、無毒、無免疫源性的藥物載體[10-11]。γ-聚谷氨酸的分子鏈上具有活性較高的側(cè)鏈羧基，易與一些抗癌藥物形成高分子藥物復合體，具有良好的藥動學特性，能通過高滲透長滯留效應（Enhanced permeability and retention effect，EPR）使藥物在腫瘤組織中積累[12]?？梢姡?聚谷氨酸是一類較理想的體內(nèi)藥用高分子材料?；诖?，本課題組將蛇葡萄素連接在γ-聚谷氨酸的羧基端以合成γ-聚谷氨酸蛇葡萄素酯（γ-PGA-AMP），并對合成產(chǎn)物進行表征和抗腫瘤活性評價，旨在提高蛇葡萄素的抗腫瘤活性，并為符合臨床需求抗腫瘤新藥的研發(fā)提供參考，為腫瘤治療提供新的選擇。蛇葡萄素、γ-聚谷氨酸和γ-PGA-AMP的結(jié)構(gòu)式見圖1。

1 材料

1.1 儀器

FD-1C-50型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）;DF-101S型集熱式磁力攪拌器（常州國華儀器有限公司）;1835型烏氏黏度計（毛細管內(nèi)徑：0.5 mm，上海隆拓儀器設備有限公司）;UV-2450型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）;740SX型傅里葉紅外光譜（FT-IR）儀（美國Nicolet公司）;Unity 500MHz型核磁共振（NMR）儀（美國Varian公司）;Vario ELⅢ型元素分析儀（德國Elementar公司）;HF212UV型CO2培養(yǎng)箱（香港力康生物醫(yī)療科技控股集團）;ELX800型酶標儀（美國BioTek公司）。

1.2 藥品與試劑

蛇葡萄素原料藥（張家界生力生物有限公司，批號：160726，純度：>98.5%）;γ-聚谷氨酸原料藥（分子量：約2×106 Da，南京軒凱生物科技有限公司，批號：20181004，純度：>92%）;透析袋（透過分子量：8 000～14 000 Da，美國聯(lián)合碳化物公司）;RPMI-1640培養(yǎng)基（批號：2016-12）、胎牛血清（批號：2017-09）、青-鏈霉素雙抗（批號：2017-05）均購自美國Gibco公司;MTT試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號：20160922）;5?氟尿嘧啶原料藥（5-FU，美國Selleck公司，批號：s1209，純度：99.97%）;二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，批號：20170314，化學純）、4-二甲氨基吡啶（DMAP，批號：20160701，分析純）、鹽酸（批號：20161018，分析純）、二甲基亞砜（DMSO，批號：20160610，分析純）、乙醚（批號：20160518，分析純）均購自國藥集團化學試劑有限公司;G 25×75型硅膠G薄層層析制備板（粒徑：100～200目，青島海洋化工有限公司）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為去離子水。

1.3 細胞

人乳腺癌細胞MCF-7、人肝癌細胞HepG2、人肺癌細胞A549等細胞株均由福建醫(yī)科大學藥學院實驗中心提供，其原代細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 小分子γ-聚谷氨酸的制備

參考文獻方法[13]，首先，純化大分子γ-聚谷氨酸原料藥：取γ-聚谷氨酸原料藥100 g，用水500 mL溶解，加入無水乙醇1 500 mL，靜置得到γ-聚谷氨酸沉淀;取沉淀，用去離子水500 mL重新溶解、超濾，除去不溶物，再次加入無水乙醇1 500 mL沉淀后，對所得沉淀進行冷凍干燥，即得白色塊狀大分子γ-聚谷氨酸。其次，采用高溫降解法降解大分子γ-聚谷氨酸：取上述大分子γ-聚谷氨酸10 g，用水配制成2%（下同）的水溶液，用鹽酸調(diào)pH至2～3，高溫高壓（121 ℃、0.1 MPa）處理20 min后，立即冰浴冷卻;用NaOH調(diào)pH至7～8，冷凍干燥，即得白色棉絮狀小分子γ-聚谷氨酸鈉鹽。最后，制備小分子γ-聚谷氨酸：用水配制2%的小分子γ-聚谷氨酸鈉鹽水溶液，用鹽酸調(diào)pH至2.0左右，用水透析48 h，冷凍干燥后，即得白色絮狀小分子γ-聚谷氨酸。

2.2 γ-PGA-AMP的合成

取蛇葡萄素0.59 g（約1.8 mmol）溶于DMSO 20 mL中，于室溫下攪拌溶解，加入DCC 0.37 g（約1.8 mmol）、DMAP 0.1 g（約0.82 mmol），再加入含有小分子γ-聚谷氨酸1.24 g（約9.37 mmol）的DMSO 180 mL，置于集熱式磁力攪拌器中，于40 ℃下攪拌反應。利用蛇葡萄素與三氯化鐵溶液反應顯紫色，采用薄層色譜（TLC）監(jiān)測酯化反應過程。反應進行24 h時，TLC顯示原料蛇葡萄素點消失，停止反應。然后在反應液中加入10倍體積的無水乙醚，洗滌、振蕩，4 ℃下靜置過夜待溶液分為兩層。收集下層淺黃色溶液，冷凍干燥后，即得黃色粉狀合成產(chǎn)物γ-PGA-AMP 1.02 g，產(chǎn)率為55.7%。

2.3 表征

2.3.1 紫外光譜檢測 取合成產(chǎn)物γ-PGA-AMP、蛇葡萄素原料藥各0.005 g，分別用DMSO 1 mL溶解，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描，結(jié)果見圖2（γ-聚谷氨酸在此范圍內(nèi)無最大吸收，圖略）。

由圖2可見，γ-PGA-AMP苯環(huán)上的最大吸收峰位于293.66 nm波長處;與蛇葡萄素相比，苯環(huán)上最大吸收峰紅移約2 nm。這可能是由于蛇葡萄素的7位羥基與聚谷氨酸a位碳上的羧基發(fā)生酯化反應，聚谷氨酸酯基團的吸電子能力略強于羥基基團，降低了分子內(nèi)電子躍遷的能級差，使分子紫外吸收發(fā)生了紅移[14-15]。另外，γ-PGA-AMP紫外光譜中200～270 nm波長范圍內(nèi)有多個γ-聚谷氨酸羧基雙鍵的吸收峰。這可能與γ-聚谷氨酸結(jié)構(gòu)中處于分子鏈末端和分子鏈內(nèi)部的羰基基團的吸收波長略有差異有關。

2.3.2 FT-IR檢測 取合成產(chǎn)物γ-PGA-AMP、蛇葡萄素原料藥各適量，分別與少量KBr混勻后壓片，于20～25 ℃下，使用FT-IR光譜儀檢測400～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的FT-IR光譜，結(jié)果見圖3（γ-聚谷氨酸在此范圍內(nèi)無最大吸收，圖略）。

由合成產(chǎn)物γ-PGA-AMP的FT-IR光譜圖（圖3A）可見，酯鍵上的碳氧單鍵σC-O：1 090、1 249 cm-1;酯鍵的羰基σC=O：1 728 cm-1;羧酸的羰基σC=O：1 646 cm-1;亞甲基σC-H：2 921 cm-1;芳環(huán)σAr-H：955 cm-1，δAr-H：1 352、1 315 cm-1（σ：伸縮震動;δ：面內(nèi)彎曲震動）。對比蛇葡萄素的FT-IR光譜圖（圖3B），3 630 cm-1處蛇葡萄素游離羥基的吸收峰已經(jīng)消失，1 650 cm-1處的羰基吸收峰由于取代基團的改變位移至1 646 cm-1。這提示蛇葡萄素上的游離羥基與γ-聚谷氨酸上的羧基可能已發(fā)生了酯化反應。

綜上所述，本研究成功合成了具有體外抗腫瘤活性的γ-PGA-AMP，且抗腫瘤活性強于蛇葡萄素，為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了新思路。

參考文獻

[ 1 ] MA JQ，SUN YZ，MING QL，et al. Ampelopsin attenuates carbon tetrachloride-induced mouse liver fibrosis and hepatic stellate cell activation associated with the SIRT1/TGF-β1/Smad3 and autophagy pathway[J]. Int Immunopharmacol，2019. DOI：10.1016/j.intimp.2019.105984.

[ 2 ] MURAKAMI T，MIYAKOSHI M，ARAHO D，et al. Hepatoprotective activity of tocha，the stems and leaves of Ampelopsis grossedentata，and ampelopsin[J]. Biofactors，2004，21（1/4）：175-178.

[ 3 ] CHENG P，GUI C，HUANG J，et al. Molecular mechanisms of ampelopsin from Ampelopsis megalophylla induces apoptosis in HeLa cells[J]. Oncol Lett，2017，14（3）：2691-2698.

[ 4 ] KOU X，CHEN N. Pharmacological potential of ampelopsin in Rattan tea[J]. Food Sci Hum Well，2012，1（1）：14- 18.

[ 5 ] WU Y，XIAO Y，YUE Y，et al. A deep insight into mechanism for inclusion of 2R，3R-dihydromyricetin with cyclodextrins and the effect of complexation on antioxidant and lipid-lowering activities[J]. Food Hydrocoll，2020. DOI：10.1016/j.foodhyd.2020.105718.

[ 6 ] TONG H，ZHANG X，TAN L，et al. Multitarget and promising role of dihydromyricetin in the treatment of metabolic diseases[J]. Eur J Pharmacol，2020. DOI：10.1016/j.ejphar.2019.172888.

[ 7 ] QI S，KOU X，LYU J，et al. Ampelopsin induces apoptosis in HepG2 human hepatoma cell line through extrinsic and intrinsic pathways：involvement of p38 and ERK[J]. Environ Toxicol Phar，2015，40（3）：847-854.

[ 8 ] RUAN LP，YU BY，F(xiàn)U GM，et al. Improving the solubility of ampelopsin by solid dispersions and inclusion complexes[J]. J Pharm Biomed Anal，2005，38（3）：457-464.

[ 9 ] SOLANKI SS，SARKAR B，DHANWANI RK. Microemulsion drug delivery system：for bioavailability enhancement of ampelopsin[J]. ISRN Pharm，2012. DOI：10.5402/2012/108164.

[10] MOHANRAJ R，GNANAMANGAI BM，RAMESH K，et al. Optimized production of gamma poly glutamic acid（γ-PGA）using sago[J]. Biocatal Agric Biotechnol，2019.DOI：10.1016/j.bcab.2019.101413.

[11] FANG Y，ZHU X，WANG N，et al. Biodegradable core- shell electrospun nanofibers based on PLA and γ-PGA for wound healing[J]. Eur Polym J，2019. DOI：10.1016/j.eurpolymj.2019.03.050.

[12] GREISH K. Enhanced permeability and retention（EPR） effect for anticancer nanomedicine drug targeting[J]. Methods Mol Biol，2010. DOI：10.1016/j.bcab.2019.101413.

[13] 周杰.馬來酰亞胺聚谷氨酸天冬氨酸靶向肽聚合物藥物載體系統(tǒng)的建立與應用[D].上海：華東師范大學，2013.

[14] ZHOU WM，HE RR，YE JT，et al. Synthesis and biological evaluation of new 5-fluorouracil-substituted ampelopsin derivatives[J]. Molecules，2010，15（4）：2114-2123.

[15] 張娜.（5-氟尿嘧啶-1-乙酸）-7-蛇葡萄素酯的合成以及活性的初步研究[D].廣州：中山大學，2007.

[16] ZHANG Y，QUE S，YANG X，et al. Isolation and identification of metabolites from dihydromyricetin[J]. Magn Reson Chem，2007，45（11）：909-916.

[17] 王庭慰，何小兵，徐虹.生物合成聚谷氨酸的相對分子質(zhì)量表征[J].南京工業(yè)大學學報，2003，25（6）：6-10.

[18] 周永，鄭金英，徐小華，等.抑制PKM2介導的糖酵解在蛇葡萄素抗乳腺癌增殖中的作用[J].腫瘤代謝與營養(yǎng)電子雜志，2019，6（2）：236-241.

[19] 劉金河，葛章文，張望明，等.二氫楊梅素對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響[J].貴州醫(yī)科大學學報，2019，44（10）：1140-1144.

（收稿日期：2020-06-16 修回日期：2020-10-15）

（編輯：鄒麗娟）