五味子甲素對四氯化碳誘導小鼠肝纖維化的保護作用及其機制研究

王肖輝 周霖 杜秋爭 師瑩瑩 荊自偉

摘 要 目的：研究五味子甲素（SA）對四氯化碳（CCl4）誘導肝纖維化模型小鼠的保護作用及其機制。方法：將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、水飛薊素組（陽性對照，100 mg/kg）和SA低、高劑量組（20、40 mg/kg），每組10只。除空白對照組外，其余組小鼠均采用皮下注射CCl4法建立肝纖維化模型。建模成功后，各給藥組小鼠灌胃相應藥物，每天1次，連續給藥6周;空白對照組和模型組小鼠同法灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。采用蘇木精-伊紅染色法觀察小鼠肝組織病理學變化;分別采用紫外分光光度法和酶聯免疫吸附法檢測小鼠血清肝損傷指標[丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）]水平和炎癥因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6]含量;采用Western blotting法檢測小鼠肝組織中NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）/核因子κB（NF-κB）和轉化生長因子β（TGF-β）/Smad信號通路蛋白的表達水平。結果：與空白對照組比較，模型組小鼠肝組織纖維化病變明顯;血清肝損傷指標水平和炎癥因子含量均顯著升高（P<0.01）;肝組織中NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白、胱天蛋白酶1、IL-1β、TGF-β1蛋白表達水平以及磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）/NF-κB p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白α（p-IκBα）/IκBα、p-Samd3/Smad3比值均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各藥物組小鼠肝組織纖維化病變均明顯減輕;小鼠血清肝損傷指標水平和炎癥因子含量以及肝組織中NLRP3/NF-κB和TGF-β/Smad信號通路蛋白的表達及磷酸化水平均顯著降低（P<0.01）。結論：SA可有效減輕CCl4誘導肝纖維化模型小鼠的肝損傷和炎癥程度，其可能是通過調節NLRP3/NF-κB和TGF-β/Smad3信號通路從而 發揮抑制肝纖維化的作用。

關鍵詞 肝纖維化;五味子甲素;NOD 樣受體蛋白3/核因子κB信號通路;轉化生長因子β/Smad信號通路;小鼠

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）22-2725-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.22.07

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the protective effect of schisandrin A （SA） on CCl4-induced liver fibrosis model mice and its mechanism. METHODS： Mice were randomly divided into blank control group， model group， silymarin group（positive control， 100 mg/kg）， SA low-dose and high-dose groups （20， 40 mg/kg）， with 10 mice in each group. Except for blank control? group， other groups were given CCl4 subcutaneously to induce liver fibrosis model. After successful modeling， administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 6 weeks; blank control group and model group were given constant volume of 0.5%sodium carboxymethyl cellulose solution intragastrically by the same way. HE staining was used to observe the pathological changes of liver tissue in mice. UV spectrophotometry and ELISA assay were adopted to detect the serum levels of liver injury indexes （ALT and AST） and the contents of inflammatory factors （TNF-α， IL-1β， IL-6）. Western blotting assay was used to detect the expression of NOD like receptor protein 3 （NLRP3）/NF-κB and TGF-β/Smad signaling pathway protein. RESULTS： Compared with blank control group， obvious pathological changes of liver fibrosis were observed in model group. The serum levels of liver injury indexes and contents of inflammatory factors were significantly increased （P<0.01）. The expression of NLRP3， apoptosis associated spot-like protein， Caspase-1 and IL-1β， TGF-β1 and ratios ofp-NF-κB p65/NF-κB p65， p-IκBα/IκBα， p-Samd3/Smad3 were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， SA could significantly relieve hepatic fibrosis in mice， reduce serum levels of liver injury indexes and contents of inflammatory factors， as well as the expression of NLRP3/NF-κB and TGF-β/Smad signaling pathway protein and phosphorylation level （P<0.01）. CONCLUSIONS： SA can effectively relieve liver injury and inflammation of CCl4-induced hepatic fibrosis model mice， which may be through the regulation of NLRP3/NF-κB and TGF-β/Smad3 signaling pathways， thus inhibiting the process of liver fibrosis.

KEYWORDS? ?Liver fibrosis; Schisandrin A; NLRP3/NF-κB signaling pathway; TGF-β/Smad signaling pathway; Mice

肝纖維化是由各種致病因子所致肝內結締組織異常增生的一種病理生理過程，后期會繼續發展成為肝硬化，是目前威脅人類生命健康的重要疾病之一[1-2]。肝纖維化的主要發生機制是由于肝組織內細胞外基質（ECM）的超速合成與緩慢降解，最終導致ECM在肝內的過度沉積，這也是各種肝損傷類疾病發生、發展過程的共有病理學基礎[3]。

中藥五味子是木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill或華中五味子Schisandra sphenanthera Rehd. et Wils.的干燥成熟果實，具有益氣滋腎、生津斂汗、寧心安神及澀精止瀉等功效，其主要有效成分為五味子甲素（Schisandrin A，SA）、五味子乙素、五味子醇甲、五味子酚等[4]。現代藥理研究表明，SA具有明顯的抗肝纖維化作用，然而其具體作用機制目前尚不明確[5-6]。邱宏濤等[7]基于網絡藥理學手段預測并驗證了五味子的主要成分SA具有顯著的抗炎作用，并能顯著降低小鼠單核巨噬細胞RAW264.7中炎性因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6的分泌水平。有研究報道，SA可抑制小鼠骨髓來源巨噬細胞中NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體的活性，而核因子κB（NF-κB）依賴的NLRP3炎性小體作為宿主免疫防御系統的重要組成部分，主要參與體內的炎癥反應，是肝纖維化形成的重要信號通路[8-9]。有研究發現，五味子提取物（SA是其中重要組成部分）可通過抑制Smad信號轉導通路從而降低轉化生長因子β（TGF-β）介導的α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的異常升高，最終起到抑制血管平滑肌細胞應激纖維形成和細胞遷移的作用[10]。由于TGF-β能夠調控其下游的Smad信號通路蛋白，刺激其磷酸化過程從而介導ECM的合成與聚集，這與病理性纖維化過程密切相關[11]，因此SA也可能通過該信號通路發揮抗纖維化作用。以上研究提示，肝纖維化與NLRP3/NF-κB和TGF-β/Smad信號通路密切相關，而SA是否可以通過干預以上信號通路從而發揮抗纖維化的作用，目前尚未有相關報道。因此，本研究采用經典的四氯化碳（CCl4）誘導法建立小鼠肝纖維化模型，并基于NLRP3/NF-κB和TGF-β/Smad信號通路，深入挖掘SA對小鼠肝纖維化的影響及其相關機制，為中藥有效成分治療肝纖維化提供研究思路和實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

ME104E型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;Heraeus Fresco 17 Centrifuge型微量冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）;DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠公司）;SpectraMax i3x型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）;RT-6000型酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）;ECLIPSE Ti2型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;ChemiDoc XRS+型全自動化學發光凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 藥品與試劑

SA對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-17022401，純度：97%）;水飛薊素對照品（陽性藥物，寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：HG1144W1，純度：98%）;TNF-α、IL-6、IL-1β酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測試劑盒和BCA蛋白提取及濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：SEKM-0034、SEKM-0007、SEKM-0002、PC0020）;丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：C010-2-1、C009-2-1）;兔源NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、胱天蛋白酶1（Caspase-1）、IL-1β、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化IκBα（p-IκBα）、TGF-β1、Smad3、磷酸化Smad3（p-Smad3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（美國Cell Signaling Technology公司，批號：13158、67824、24232、12703、59674、8214、4812、8219、3709、9513、9520、5174、4414）;高敏型ECL化學發光檢測試劑盒（南京唯諾贊生物科技股份有限公司，批號：E412-02）;RIPA裂解液（碧云天生物技術有限公司，批號：P0013B）;羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑及聚丙烯酰胺凝膠等其余試劑均購自上海阿拉丁試劑公司，實驗用水為三級水。

1.3 動物

50只雄性ICR小鼠，8～12周齡，體質量18～22 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[動物生產許可證號：SCXK（滬）2020-0006]。所有動物于室溫（22±1） ℃、空氣濕度40%～50%、晝夜交替時間12 h/12 h條件下，以普通飼料喂養并自由飲水。

2 方法

2.1 造模

采用經典的CCl4誘導法[12]建立小鼠肝纖維化模型：將CCl4與橄欖油按體積比1 ∶ 1配制成油溶液后進行小鼠皮下注射，注射體積為3 mL/kg，每周2次（間隔3 d），連續注射6周。空白對照組小鼠同法注射等體積橄欖油。肝纖維化模型復制成功的評判標準[13]：基本體征方面表現為活動減少、反應遲鈍，毛色粗糙、灰暗、無光澤;生化指標方面表現為血清中肝損傷指標AST、ALT水平以及血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯升高;病理學變化方面表現為肝小葉結構破壞，有炎性細胞浸潤，并出現大量纖維增生。

2.2 分組與給藥

將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、水飛薊素組（100 mg/kg）和SA低、高劑量組（20、40 mg/kg），每組10只。按“2.1”項下方法分別注射橄欖油或CCl4油溶液建立模型。末次皮下注射24 h后，水飛薊素組和SA低、高劑量組小鼠分別灌胃相應藥物（SA和水飛薊素均以0.5%CMC-Na生理鹽水溶液為溶劑，分別配制成5、2 mg/mL的混懸液后給藥;給藥劑量參考相關文獻并按動物劑量換算而得[14-16]），灌胃體積均為20 mL/kg（其中SA低劑量組用生理鹽水補足灌胃體積至20 mL/kg）;空白對照組和模型組小鼠灌胃等體積0.5%CMC-Na生理鹽水溶液。各組小鼠均每天給藥1次，連續給藥6周。

2.3 小鼠血清中肝損傷指標水平檢測

末次灌胃給藥24 h后，于小鼠眼眶取血并制備血清。取部分血清樣品，嚴格按相應試劑盒說明書操作，按紫外分光光度法采用酶標分析儀檢測血清中AST和ALT的水平。

2.4 小鼠血清中炎癥因子含量檢測

取“2.3”項下小鼠血清樣品，嚴格按照相應ELISA檢測試劑盒說明書操作，以多功能酶標儀檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

2.5 小鼠肝組織病理學檢查

小鼠取血完畢后，給予戊巴比妥麻醉并處死，立即取出肝臟，在4%中性甲醛溶液中固定過夜，脫水，石蠟包埋，切片（4 μm）后進行HE染色，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 小鼠肝組織中NLRP3/NF-κB及TGF-β/Smad信號通路蛋白表達水平檢測

采用Western blottting法進行檢測。取“2.5”項下肝組織適量，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上充分裂解，提取總蛋白，并采用BCA法測定蛋白含量。取蛋白樣本50 μg，變性處理后，采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉至聚偏氟乙烯薄膜上，于4 ℃下用5%脫脂牛奶封閉2 h;然后加入NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、TGF-β1、Smad3、p-Smad3抗體（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育過夜;用TBST緩沖液洗膜，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 10 000），室溫孵育2 h;用TBST緩沖液洗膜，加入ELC發光液后，在全自動化學發光凝膠成像分析系統中曝光顯影。采用Image J 1.8.0軟件對目的蛋白條帶進行分析，以GAPDH為內參，以各目標條帶與內參的灰度值比值表示其蛋白表達水平，以p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα、p-Smad/Smad3灰度值比值表示相應蛋白的磷酸化水平。

2.7 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。計量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 SA對肝纖維化模型小鼠血清肝損傷指標水平的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清中ALT和AST水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，水飛薊素組和SA低、高劑量組小鼠血清中ALT和AST水平均顯著降低（P<0.01），詳見表1。

3.2 SA對肝纖維化模型小鼠血清炎癥因子含量的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，水飛薊素組和SA低、高劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著降低（P<0.01），詳見表2。

3.3 SA對肝纖維化模型小鼠肝組織病理學變化的影響

空白對照組小鼠肝細胞索排列規則，細胞結構完整，小葉輪廓清晰;模型組小鼠肝細胞出現明顯水腫，肝細胞體積變大，肝中央靜脈結構異常、充血擴張，肝細胞索呈不規則排列，有炎性細胞浸潤;水飛薊素組和SA低、高劑量組小鼠肝細胞炎性病變及壞死程度均較模型組明顯減輕，其肝組織病理變化程度處于空白對照組與模型組之間，詳見圖1（圖中，“箭頭”所指為炎性病變和壞死的區域）。

3.4 SA對肝纖維化模型小鼠肝組織中NLRP3/NF-κB及TGF-β/Smad信號通路蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠肝組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TGF-β1蛋白的表達水平以及p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα、p-Smad/Smad3比值均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，水飛薊素組和SA低、高劑量組小鼠肝組織中上述蛋白表達水平及比值均顯著降低（P<0.01），詳見圖2、表3（注：圖2中p-NF-κB p65/NF-κB p65為p-NF-κB/NF-κB在體內的活化亞基形式）。

4 討論

肝纖維化的主要病理學機制是由于肝組織內ECM的超速合成與緩慢降解，最終導致肝內ECM的過度沉積[3，17]。肝星狀細胞（HSC）是彌散性ECM的主要來源，且活化的HSC還可進一步轉化為肌成纖維細胞，是肝纖維化發生的關鍵環節[18]。當前治療肝纖維化的藥物可在一定程度上限制疾病的快速發展，然而抗纖維化治療藥物的研究仍然以針對病因為主，真正直接干預纖維化的特異性藥物的研發較少，臨床治療效果并不明顯[19]。臨床常規手段主要是依靠對癥治療，如使用保肝降酶藥物等，但這些手段并不能從根本上解決問題，反而有引起藥源性疾病的風險。SA是從中藥五味子中提取出的主要有效成分，具有保肝護肝、逆轉肝損傷的作用，是當前臨床治療肝纖維化的有效補充手段，能夠明顯改善患者肝功能，阻斷疾病發生發展的關鍵靶點通路，從而發揮高效低毒的治療作用[4，6]。因此，本研究以經典的天然保肝藥物水飛薊素[16]為陽性對照，通過小鼠肝纖維化模型對SA改善肝損傷和肝纖維化的作用及其相關信號通路機制進行了探索。

AST和ALT是反映肝功能的兩個重要生化指標，當發生肝功能異常時，AST和ALT將會從肝細胞中被外排到達血液循環，從而表現為血液中這兩項指標水平的急劇升高[20]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT水平均顯著升高，表明CCl4誘導的模型小鼠的肝功能明顯受損;而給予水飛薊素和不同劑量SA干預后，小鼠血清中上述肝損傷指標水平均顯著降低，提示SA對小鼠肝功能有明顯的保護作用。

炎癥途徑在肝纖維化中起著至關重要的作用，研究證實，肝Kuffer細胞在損傷期間會募集中性粒細胞和T淋巴細胞等，并釋放促炎介質如TNF-α、IL-1β、IL-6等，同時刺激HSC的纖維化活性[21]。因此，TNF-α、IL-1β、IL-6參與和促進了肝纖維化的進程，并可用于表征肝細胞的纖維化程度，是研究肝纖維化的重要生物學指標。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著升高，表明CCl4誘導的模型小鼠出現了明顯的肝纖維化，實驗模型建立成功;而給予水飛薊素和不同劑量SA干預后，小鼠血清中上述炎癥因子含量均顯著降低，提示SA能明顯減輕模型小鼠的肝纖維化程度。

本研究通過HE染色法觀察小鼠肝組織病理學變化，結果顯示，對照組小鼠細胞結構清晰、細胞索規則排列，無炎癥浸潤現象;模型組小鼠出現細胞水腫體積變大，細胞核聚集、皺縮以及炎性細胞浸潤等現象，細胞索排列不規則，表明肝纖維化模型成功建立;而給予水飛薊素和低、高劑量SA干預后，小鼠肝細胞炎性病變及壞死程度均較模型組明顯減輕，提示SA能明顯緩解模型小鼠的肝纖維化病理進展程度。

NLRP3/NF-κB信號通路的激活可導致炎癥水平升高，進而促進纖維化進程中的作用已被證實，并被認為是經典的肝纖維化信號通路[22]。機體靜息狀態下，NF-κB可與IκBα結合形成三聚體，并在細胞質中以無活性的形式存在;而在被NLRP3等炎性小體刺激后，則可誘導炎癥反應的發生，且以p65/p50異二聚體的活化形式存在[23]。NLRP3炎性小體是宿主免疫防疫系統的重要成員，該炎癥小體主要由NLRP3、Caspase-1和ASC等3種蛋白組成;同時，Caspase-1可以將無活性IL-1β前體（pro-IL-1β）剪切為IL-1β并釋放到胞外，從而引發下游炎癥反應，而IL-1β是NLRP3下游炎癥通路中的重要因子[24-25]。上述4種蛋白的表達水平升高，則提示機體炎性水平升高、炎癥通路被激活。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠肝組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β蛋白表達水平以及p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα比值均顯著升高，表明模型組小鼠出現明顯的肝纖維化;而給予水飛薊素和不同劑量SA干預后，小鼠肝組織中上述5個蛋白的表達水平均顯著降低，表明SA可能是通過干預NLRP3/NF-κB信號通路從而起到有效減輕小鼠肝纖維化的作用。

TGF-β1是目前公認的最強促纖維化因子之一，其主要通過促進纖維細胞增殖、轉化和轉分化，以及在轉錄和轉錄后水平調節膠原等ECM的表達并有效抑制其降解來高效促進組織纖維化[26]。Smad蛋白是TGF-β1信號轉導至核內關鍵的下游信號物質，TGF-β1可通過增加Smad3磷酸化水平來發揮其促肝纖維化的作用[27]。Smad7是該信號通路的負調節因子，可以通過與Smad3產生競爭性抑制，從而阻斷TGF-β/Smad3信號傳導，最終抑制肝纖維化的發生[28];且已有實驗證實敲除Smad7編碼基因后，小鼠肝纖維化可在短時間內快速形成[29]。因此，TGF-β/Smad3信號通路是肝纖維化形成的關鍵重要信號通路。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠肝組織中TGF-β1蛋白表達水平以及p-Smad3/Smad3比值均顯著升高，表明模型小鼠肝纖維化程度加重;而給予水飛薊素和不同劑量SA干預后，小鼠肝組織中TGF-β1蛋白表達水平以及p-Smad3/Smad3比值均顯著降低，表明SA可干預TGF-β/Smad3通路信號轉導，有效抑制TGF-β1的表達和Smad3的活化，從而抑制肝纖維化的疾病進展。

綜上所述，SA可有效減輕CCl4誘導肝纖維化模型小鼠的肝損傷和炎癥程度，其可能是通過調節NLRP3/NF-κB和TGF-β/Smad3信號通路從而發揮抑制肝纖維化進程的作用。

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（收稿日期：2020-06-23 修回日期：2020-10-20）

（編輯：段思怡）