平貝母鱗莖腐爛病病原菌鑒定和藥劑篩選

王爽 李新民 劉春來

摘要 為明確平貝母Fritillaria ussuriensis鱗莖腐爛病的病原菌及其防治，對病原菌進行分離、致病性測定，通過形態學特征、ITS rDNA、β-tubulin及EF-1α基因序列分析確定其病原為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum和芳香鐮刀菌F.redolens。通過菌絲生長速率法，對病原菌進行了室內藥劑篩選，表明8種藥劑中25%多菌靈可濕性粉劑和43%戊唑醇懸浮劑對病原菌有更好的抑制作用，處理第6天，EC50均不超過0.7 mg/L。對兩種病原菌防效最好的藥劑是戊唑醇，EC50分別為0.107、0.169 mg/L。這兩種藥劑可以選擇應用于平貝母生產來防治莖腐病。

關鍵詞 平貝母; 莖腐病; 尖孢鐮刀菌; 芳香鐮刀菌; 藥劑篩選

中圖分類號： S 435.67

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019167

Abstract To make clear the fungal pathogen species of the bulb rot of Fritillaria ussuriensis and the control， pathogens were isolated and their pathogenicities were tested. Based on morphological characteristics，ITS rDNA，β-tubulin and EF-1α gene sequences analysis， pathogens were identified were Fusarium oxysporum and F.redolens. Indoor inhibitory activity analysis of eight kinds of fungicides demonstrated that two kinds of fungicides including carbendazim 25% WP and tebuconazole 43% SC had better inhibitory effect on two pathogens. With EC50 values no more than 0.7 mg/L. Results showed that tebuconazole was the best agent to inhibit the mycelia of the two pathogens， with the EC50 values were 0.107 mg/L and 0.169 mg/L， respectively. Thus， these two kinds of fungicides can be recommended as alternative agents for field testing.

Key words Fritillaria ussuriensis; stem rot; Fusarium oxysporum; F.redolens; fungicide selection

平貝母是百合科Liliaceae貝母屬Fritillaria多年生草本植物，現為中國藥典收載品種，也是我國東北特產藥材之一。其鱗莖性味平苦，具有清熱解毒、潤肺止咳化痰、散結消痛的功效，近代藥理學表明，平貝母具有抗炎，抗血小板聚集，降血壓，抗癌等功效[1]。隨著供給側結構改革和黑龍江省種植業結構調整的要求，近年來，平貝母的種植面積逐步擴大，但由于多年的連作，平貝母病害發生日趨嚴重，已嚴重影響平貝母種植業的發展[2]。國內已有報道的平貝母病害有：菌核病，病原為座盤菌Stromatinia rapulum[3]，主要為害平貝母鱗莖和莖基部;銹病，病原菌為百合單孢銹菌Uromyces lilli[4]，主要侵染莖葉，造成平貝母地上部分提前枯萎死亡;灰霉病，病原菌為橢圓葡萄孢菌Botrytis elliptica[5]，主要侵染葉片、莖、花、幼果，后期導致植株枯萎死亡;根腐病，病原菌為茄鐮刀菌藍色變種Fusarium solani[6]，主要危害根，部分或全部變色腐爛，組織遭到破壞，莖、葉也因根部無法供應水分而下垂，干枯;黑腐病，病原菌為Sclerotium denigrans和Sclerotinia sclerotiorum[7]，鱗片被害時產生黑斑，病斑下組織變灰，嚴重時整個鱗片變黑，皺縮干腐，鱗莖表皮下形成大量小米粒大小的黑色菌核。

海林地區平貝母的總種植面積有466.7 hm2，其中橫道河子鎮的平貝母種植面積有333.3 hm2，多為農戶種植，每戶種植667～1 334 m2。平貝母均有不同程度的腐爛病發生，田間表現為種植的次年不出苗，或相鄰地塊不出苗。地下鱗莖腐爛，嚴重地塊腐爛面積達80%，幾乎絕產，造成了該地區平貝母產業的巨大經濟損失。2018年5月對該地區的病樣進行了采集，病原菌的分離和鑒定及室內防治藥劑篩選工作。以期為該地平貝母病害的有效防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

平貝母病樣于2018年5月31日采自海林橫道河子鎮二十二村平貝母種植基地。培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL;馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。

供試藥劑：250 g/L嘧菌酯懸浮劑，先正達南通作物保護有限公司;80%代森錳鋅可濕性粉劑，美國陶氏益農公司;25%多菌靈可濕性粉劑，江西中訊農化有限公司;20%腐霉利懸浮劑，江西禾益化工有限公司;70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，山東省濟南一農化工有限公司;43%戊唑醇懸浮劑，拜耳股份公司，珠海經濟特區瑞農植保技術有限公司分裝;25%溴菌腈乳油，江蘇托球農化股份有限公司;500 g/L異菌脲懸浮劑，蘇州富美實植物保護劑有限公司。

試劑及儀器：真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA純化試劑盒、酶均購自康為世紀生物科技有限公司。引物ITS1/ITS4、B36F/B12R由華大基因科技服務有限公司合成。純化的PCR產物送華大基因科技服務有限公司完成序列分析。人工培養箱，上海福瑪實驗設備有限公司;Power Pac 200 Bio-Rad電泳儀;Biofuge離心機D-37520;Eppendorf Mastercycler PCR儀;OLYMPUS BX43F生物學顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離

采用常規組織分離方法進行病原菌的分離。無菌水沖洗感病鱗莖，無菌濾紙吸干表面水分，選取病健交界處組織，切取2～3 mm大小的組織，70%乙醇消毒10 s，再用0.1%的升汞表面消毒2～3 min，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干水分后，將組織塊置于添加鏈霉素的PDA平板上，置25℃恒溫培養箱黑暗培養，待形成菌落后進行菌絲先端挑取純化，將純化的菌株接種于PDA斜面培養后，放于4℃冰箱中保存備用。

1.2.2 菌株致病性測定

根據柯赫氏法則，采用離體接種法將分離的菌株接種于PDA平皿培養7 d，7 mm打孔器打菌碟備用。選取健康平貝母植株鱗莖，沖洗干凈后用70%乙醇表面消毒處理30 s，無菌條件下切去毛細根和地上部分，放于鋪有濾紙的無菌培養皿內，在鱗莖上部用針刺傷口并放置分離的菌餅，以不加菌餅作為對照，25℃保濕培養，定期觀察直至出現發病癥狀。對發病組織部位進行再分離，最后通過培養性狀觀察和普通顯微鏡鏡檢結果，確定分離得到的病原菌與初接病原菌是同一病菌。

1.2.3 病原菌的鑒定

形態學鑒定：純化的病原菌接種于PSA、PDA平板，25℃黑暗培養4～14 d，觀察記錄菌落生長情況;顯微鏡下觀察菌絲與產孢情況。參照《常見鐮刀菌鑒定指南》[8]《鐮刀菌屬》[9]中對鐮刀菌的形態特征描述確定其分類地位。

分子生物學鑒定：將純化的病原菌菌株接入PDA平板培養7 d，以滅菌牙簽刮取菌絲 1 g左右，加入液氮快速研磨。采用真菌基因組DNA提取試劑盒，參照試劑盒說明書進行DNA提取，電泳觀察，最后將抽提的DNA于-20℃保存備用。選用擴增真菌18S序列的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR反應體系為2×Taq PCR Master Mix緩沖液25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，真菌基因組DNA 2 μL，ddH2O加至50 μL。PCR反應條件：95℃ 預變性5 min;94℃變性1 min，55℃ 退火1 min，72℃ 延伸1.5 min，35個循環;72℃延伸10 min;4℃保存。選用擴增真菌β-tubulin序列引物B36F（5′-CACCCACTCCCTCGGTGGTG-3′）、B12R（5′-CATGAAGAAGTGAAGACGCGGGAA-3′）。PCR反應體系同上。PCR反應條件：預變性94℃ 4 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環;72℃延伸10 min。選用EF-1α引物EF-1（5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′）、EF-2（5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′），PCR 反應體系同上。PCR 擴增程序為：94℃預變性 3 min;94℃變性 30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s， 35個循環;最后 72℃延伸 10 min。PCR擴增產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳，送華大基因公司測序。

序列提交GenBank核酸序列數據庫（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行同源性搜索。找出與獲得片段同源性最高的真菌菌株參考序列。

1.2.4 殺菌劑對病原菌的室內藥劑篩選

按藥劑標識常用濃度設定3個濃度梯度，初步淘汰抑菌效果較差的藥劑。后根據篩選結果調整設定5個藥劑濃度梯度，做回歸方程。藥劑用無菌水稀釋相應濃度后，添加到45～50℃的PDA培養基中，制成混藥培養基，使其培養基藥劑有效成分含量為設置濃度（見表1），每處理4個重復。對照組加入等量無菌水。直徑5 mm的PDA病原菌菌餅，接種于含藥平板中央， 25℃恒溫培養箱黑暗培養。6 d后，按十字交叉法測量菌落直徑，取其平均值。菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.3 數據分析

SPSS 13.0分析軟件根據各藥劑濃度對數值及相對應的菌絲生長抑制率幾率值作回歸分析。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

染病葉片初為水浸狀，后期淡紫色，最后黃色枯萎，地下鱗莖局部變軟棕褐色腐爛，嚴重者內部完全腐爛只剩鱗莖的皮或整體腐爛殆盡。

2.2 病原菌分離和鑒定

2.2.1 病原菌分離和致病性測定

經離體接種試驗，可導致平貝母鱗莖發病腐爛的菌株有兩類，分別以P6-1和P4-3為代表。接種P6-1菌株后，平貝母鱗莖表面附著濃密菌絲體，鱗莖內部變軟腐爛，20 d后只剩一層菌絲包裹的皮;接種P4-3菌株后，平貝母鱗莖表現為接種部位變褐色、變軟腐爛直至整個鱗莖（圖2）。通過培養性狀觀察和普通顯微鏡鏡檢結果，確定分離得到的病原菌與初接病原菌是同一病菌。

2.2.2 病原菌的鑒定

經顯微鏡觀察菌株P6-1、P4-3均有鐮刀菌的特征，在PDA和PSA培養基上的形態無明顯差異。PDA培養基上兩菌株上的菌落初期均為白色。后期菌株P6-1的菌落為紫色，4 d的菌落直徑為4.2～4.5 cm，其菌絲體呈絨卷毛狀，小型分生孢子卵圓形或腎形，著生在側生瓶狀小梗上或假頭狀著生，大小（4.73～12.78）μm×（2.12～3.94）μm，大型分生孢子美麗型，月牙形，稍彎，向兩端比較均勻的變尖，基胞足跟明顯，多2～3隔，大小（13.7～28.41）μm×（2.76～4.54）μm，易產生厚垣孢子，直徑9.64～14.71 μm。菌株P4-3菌落后期為米色，4 d的菌落直徑為3.95～4.2 cm，其菌絲體低平，毛狀（直立），小型分生孢子卵圓形著生在側生瓶狀小梗上或假頭狀著生在產孢細胞上，大小（4.94～17.39）μm×（272～4.63）μm，大型分生孢子介于美麗型和馬特型之間，比尖孢鐮刀菌稍寬，兩端比尖孢鐮孢較鈍。少有分隔，分隔不明顯，大小（13.47～30.78）μm×（35～4.99）μm，易產生厚垣孢子，直徑8.69～1157 μm（圖3、4）。

菌株P6-1和P4-3采用通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增后得到的片段收錄在GenBank，登錄號分別為MK510933、MK510931。將供試菌系的rDNA-ITS序列于GenBank數據庫進行 BLAST 同源性比對。分別與登錄號為MH911386的F.oxysporum和登錄號為MH660908的F.redolens相似度為100%。菌株P6-1和P4-3通過β-tubulin基因PCR擴增和測序分析得到的序列分別與收錄在GenBank登錄號為KJ127286的F.oxysporum和登錄號為KU171788的F.redolens的遺傳距離最近。菌株P6-1和P4-3通過EF-1α基因PCR擴增和測序分析得到的序列通過構建系統發育樹發現分別與收錄在GenBank登錄號為KX940969的Foxysporum和登錄號為KF055839的F.redolens的遺傳距離最近，聚在一起（圖5）。結合形態學觀察確定這兩種病原菌為尖孢鐮刀菌和芳香鐮刀菌。

2.3 殺菌劑對病原菌的室內藥劑篩選

2.3.1 初篩

結果表明，供試的8種藥劑對病原菌的抑制效果明顯不同，其中多菌靈和戊唑醇表現出很好的抑菌效果，相對少的用量對2種病原菌有著相對高的抑菌率，其他藥劑的用量高且防效差。多菌靈每升PDA培養基有效成分含量2 mg的濃度下，第6天對兩種病原菌的菌絲抑制率均超過了95%。戊唑醇每升PDA培養基有效成分含量1.72 mg的濃度下，第6天對兩種病原菌的菌絲抑制率均超過了78%（表1）。

2.3.2 多菌靈和戊唑醇對病原菌的抑制作用

結果表明2種藥劑對2株病原菌的EC50均不超過0.7 mg/L，對尖孢鐮刀菌和芳香鐮刀菌菌絲抑制率最好的藥劑是戊唑醇，其EC50分別為0107、0169 mg/L（表2）。

3 討論

目前還沒有關于平貝母由尖孢鐮刀菌和芳香鐮刀菌引起病害的報道。高啟超等報道，尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌F.moniliforme和茄病鐮刀菌可以引起安徽貝母F.anhuiensis鱗莖腐爛，并指出用50%的多菌靈或硫菌靈和40%甲基異柳磷1 000倍混合藥液浸種30 min，晾干后播種， 能殺死鱗莖表面的病菌[10];廖蔚文等報道燕麥細鐮孢霉F.avenaceum可以引起湖北五峰縣栽培貝母的干腐病，用40%多菌靈膠懸劑50倍液浸種，次年3月成苗率為93.3%，而對照為67.7%[11];周茂繁等報道湖北貝母F.hupehensis爛種病原為尖孢鐮刀菌，并指出40%多菌靈膠懸劑500倍液浸種具有很好的防效[12];此外尖孢鐮刀菌可以引起與貝母同科的百合鱗莖腐爛病，在百合種球播種前，使用多菌靈浸種，可有效預防病害發生[13]。尖孢鐮刀菌和芳香鐮刀菌可以寄生多種植物[14]，這兩種病原菌同屬美麗組鐮刀菌，形態上芳香鐮刀菌介于尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌之間且這兩個種的多數類群是多種作物嚴重枯萎的主要病原[9]。本試驗證明多菌靈和戊唑醇對這兩種病原菌有很好的抑制作用，且戊唑醇的致死中濃度更低。

平貝母既可進行有性繁殖，又可進行無性繁殖。用種子繁殖生長周期長，收益較慢，一般需 6年左右方能收獲;用鱗莖繁殖，2年便可收益，故生產上多采用鱗莖繁殖法[15]。所以對平貝母鱗莖腐爛病的防治顯得尤為重要。

本研究首次提出平貝母莖腐病的兩種新的病原菌，并對當前常用藥劑對其防效進行了篩選，對平貝母鱗莖腐爛病害防治有一定的指導作用。本試驗只對病原菌進行了室內的藥劑篩選，田間防治效果有待進一步試驗研究，但是田間藥劑篩選應用還需綜合考慮環境、施藥方式、對平貝母鱗莖的影響及農藥殘留等多種因素。

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（責任編輯：田 喆）