EMSCs復合CPC支架體外生物相容性的研究

陳琛 許安平

摘要：目的 ?觀察磷酸鈣骨水泥（CPC）對鼻粘膜間充質干細胞（EMSCs）體外誘導成骨的影響。方法 ?取出SD大鼠的全層鼻粘膜行體外培養并擴增EMSCs，選取第三代生長狀況良好的EMSCs與CPC混合培養，行成骨誘導14天。將EMSCs/CPC設定為CPC材料組，單純EMSCs培養為對照組。ALP檢測兩組EMSCs堿性磷酸酶活性，茜素紅染色法測定鈣結節面積大小，免疫印跡法檢測成骨誘導相關蛋白表達水平;鬼筆環肽染色法動態觀察EMSCs在CPC表面的細胞形態;MTT法檢測CPC對EMSCs增殖的影響，并進行統計學分析。結果 ?①CPC材料組較對照組中堿性磷酸酶活性在成骨誘導14 d后較高，染色程度深;茜素紅染色中CPC材料組的鈣結節更大;鬼筆環肽染色液染色第3天EMSCs形態呈圓形，細胞形態未完全伸展，第7天EMSCs呈長梭型，第14天后EMSCs成堆生長;免疫印跡法檢測CPC材料組表達collagen I和osteocalcin高于對照組（P<0.05）;②細胞接種后，CPC材料組和對照組隨在前5 d內保持正常的增殖速度，兩者之間無明顯差異，第7天開始可見明顯的促進作用，兩組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 ?CPC是一種優良的組織工程支架材料，能夠促進EMSCs體外增殖以及誘導成骨，EMSCs與CPC之間具有良好的生物相容性。

關鍵詞：EMSCs;CPC;生物相容性

中圖分類號：R318.08 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.23.020

文章編號：1006-1959（2020）23-0068-05

Abstract：Objective ?To observe the effect of calcium phosphate cement （CPC） on the induction of osteogenesis of nasal mucosal mesenchymal stem cells （EMSCs） in vitro.Methods ?The full-thickness nasal mucosa of SD rats was taken out and cultured in vitro and expanded EMSCs. The third-generation EMSCs with good growth condition were mixed and cultured with CPC， and osteogenic induction was performed for 14 d. Set EMSCs/CPC as the CPC material group， and cultivate pure EMSCs as the control group. ALP was used to detect the alkaline phosphatase activity of the two groups of EMSCs， the alizarin red staining method was used to determine the size of calcium nodules， the Western blotting method was used to detect the expression level of osteoinduction-related proteins; the phalloidin staining method was used to dynamically observe the cell morphology of EMSCs on the CPC surface; MTT method was used to detect the impact of CPC on the proliferation of EMSCs and perform statistical analysis.Results ?①The alkaline phosphatase activity in the CPC material group was higher than that in the control group after 14 d of osteogenic induction， and the staining degree was deeper;In Alizarin Red staining， the calcium nodules in the CPC material group were larger; on the third day of staining with phalloidin staining， the EMSCs were round in shape and the cell morphology was not fully extended. On the 7th day， the EMSCs were in a long spindle shape， and after the 14th day，growth in piles; the expression of collagen I and osteocalcin in the CPC material group detected by western blotting was higher than that of the control group （P<0.05）; ②After cell inoculation， the CPC material group and control group maintained normal proliferation rates within the first 5 d. There was no significant difference between the patients， and the obvious promotion effect was seen on the 7th day，the difference between the two groups was statistically significant（P<0.05）.Conclusion ?CPC is an excellent scaffold material for tissue engineering， which can promote the proliferation of EMSCs and induce bone formation in vitro. There is good biocompatibility between EMSCs and CPC.

Key words：EMSCs;CPC;Biocompatibility

骨缺損（bone defect）的治療是臨床常見的難題，骨移植術是目前臨床治療骨缺損的重要方法之一，但各種骨移植術都有一定的局限性。通常都會因為取骨量有限，需進行二次手術，對患者機體損傷較大，發生免疫反應等因素影響治療效果[1，2]。磷酸鈣骨水泥（calciumphosphate cement，CPC）具有良好的生物相容性以及骨誘導性，是臨床常見的植骨材料[3]。外胚間充質干細胞（ectomesenchymal stem cells，EMSCs）是一種具有多向分化的潛能的特殊類型干細胞[4]。因其取材量大、手術操作方便、損傷小，是骨組織工程良好的種子細胞[5]。本課題組既往研究表明EMSCs在特定的條件下可以被誘導成骨，并可高表達干細胞標志蛋白[6]?；诖?，本研究通過體外培養EMSCs，復合CPC培養，探討CPC與EMSCs的生物相容性和EMSC成骨細胞分化的水平，現報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物、試劑與儀器 ?6周齡健康雄性SD大鼠（體質量約150 g）購于江蘇大學動物實驗中心（動物使用許可證：SCXK蘇2002-0045）;CPC（購自英國施樂輝公司）;胎牛血清（Gibco，USA）、0.25 %胰酶（Sigma）;DMEM/F12購于hyclone通用公司（美國）。二巰基乙醇購于鼎國生物科技有限公司（北京）;羊抗兔collagen I和osteocalcin，羊抗鼠nestin和vimentin，山羊抗鼠-cy3 IgG，山羊抗兔-cy3 IgG，山羊抗兔IgG HRP，山羊抗鼠IgG HRP，購于武漢博士德公司;鬼筆環肽購于Sigma公司;堿性磷酸酶檢測試劑盒購于索來寶公司;多聚甲醛干粉購于國藥有限公司;Triton-100購于北京生物化學試劑公司。

1.2方法

1.2.1 CPC ?制備CPC按照產品規格說明進行調拌混勻，平鋪于24孔培養板中，待其凝固，厚度約為0.5 mm。

1.2.2鼻粘膜間充質干細胞的分離、原代培養及傳代 ?SD大鼠頸椎脫位，無菌分離大鼠下鼻甲，置于4℃PBS中，去除鼻中隔軟骨，分離全層鼻粘膜;鼻粘膜取出后用無血清DMEM/F12漂洗3 次，然后用眼科剪充分剪碎，去除上清液，加入0.25% 胰酶37 ℃消化10 min，PBS漂洗3次，離心，去除胰酶，后接種于細胞培養瓶，加入4 ml 10% FBS 的DMEM/F12（含青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml），置于CO2培養箱內（37 ℃，5% CO2，飽和濕度）培養，每隔2 d半量換液，當細胞鋪滿瓶底85%時，進行傳代培養，選取第3代EMSCs備用。

1.2.3 EMSCs表面標志鑒定 ?待第3代EMSCs細胞鋪滿培養板底的75%時，用4%多聚甲醛4℃固定8 h，PBS漂洗3次，每次10 min，洗去多余的多聚甲醛;然后2% BSA封閉30 min，0.1% Triton-100破膜30 min，PBS洗3遍，加入一抗：nestin和vimentin，4℃孵育12 h，漂洗一抗;然后加入山羊抗鼠二抗（cy3-IgG，1∶250），37 ℃孵育1 h，DAPI染核，甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 MTT法檢測EMSCs增殖活性 ?CPC材料組以0.25%胰酶消化生長狀態良好的第3代EMSCs制成的細胞懸液，5×109/L吸取100 μl分別滴加到已置入24孔板的CPC表面，37 ℃，體積分數5%CO2飽和濕度放置2 h后，反轉材料，向該材料另一面滴加100 μl細胞懸液，行混合培養。分別于第1、3、5、7、14 d，用無血清的DMEM 細胞培養液沖洗CPC支架，以去除未貼壁的細胞，并將EMSCs/CPC復合支架移入新的無菌培養板中，每孔加入0.01 mo1/L MTT 溶液100 μl，繼續培養4 h 后，小心吸除培養液，每孔加入500 μl DMSO，振蕩10 min后，取200 μl溶解液轉入96 孔板中，選擇波長490 nm，在酶聯免疫測試儀上測定OD值。以EMSCs直接接種于24孔板培養作為對照組。

1.2.5鬼筆環肽染色 ?配制0.01%的鬼筆環肽染色液，取種植于CPC表面第3、7、14天的EMSCs，棄去培養基，PBS漂洗3遍，加入鬼筆環肽工作液，37℃作用30 min，甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察EMSCs形態。

1.2.6成骨細胞分化的誘導方法 ?選取生長狀況良好第3代EMSCs細胞分別接種在鋪有CPC的24孔細胞培養板，當細胞鋪滿培養板底的85%時，棄去培養液，PBS洗2次，加入足量的成骨誘導培養基（10 mmol/L β-磷酸甘油鈉、25 μg/L 抗壞血酸、15%FBS 及含有0.1 μmol/L地塞米松的DMEM），每7 d換液，對照組同樣方式處理，成骨細胞誘導14 d。

1.2.7堿性磷酸酶（ALP）活性檢測 ?ALP活性測定按照試劑盒說明書配制工作液，分別取成骨誘導培養7和14 d 的各組EMSCs，棄去培養液，PBS漂洗3次，0.25%胰酶消化細胞，反復吹打培養板后加入等量含10%PBS的培養基終止消化，取出培養板，培養液離心，制懸。加入ALP工作液，37 ℃作用1 h，甘油封片后于顯微鏡下觀察。

1.2.8鈣結節染色 ?配制0.3%的茜素紅染液;成骨誘導培養7和14 d 的各組細胞，4%多聚甲醛固定20 min，ddH2O小心漂洗3 次;干燥;加入適量的0.3%茜素紅染液，作用30 min;棄去染液;再次干燥;甘油封片后于倒置顯微鏡下觀察細胞外鈣鹽沉積情況，采用Image-Proplus軟件計算形成鈣結節的面積。

1.2.9免疫印跡 ?取成骨誘導14 d的EMSCs，PBS洗3遍，每個孔中加入含有1%蛋白酶抑制劑的裂解液100 μl置于冰上1 h，后輕輕刮取置于EP 管中。在4℃下10000 r/min 離心10 min，吸取上清液煮沸后-20℃保存。加樣品于10% SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，350 mA 恒流轉膜90 min，PVDF用3% 脫脂奶粉封閉1 h。將膜分別與對應的一抗collagen（1∶500）、osteocalcin（1∶500） 和β-tubulin 4℃孵育12 h，之后TBST 漂洗3次，10min /次。加入抗兔或抗鼠IgG-HRP（1∶5000），37℃孵育1 h，TBST 漂洗3次，10 min/次。用超敏形ECL發光液顯示陽性條帶，在Typhoon系統上掃描結果，Image J軟件分析灰度值。

1.3統計學方法 ?采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計量資料用（x±s）表示，采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 EMSCs的形態學和表面標志鑒定 ?組織培養3 d后開始貼壁生長，5 d后可見較多貼壁細胞，呈長梭形，形態均勻。純化后的細胞貼壁速度加快，增殖能力更強。免疫熒光結果顯示90%的EMSCs表達nestin和vimentin，提示獲得了較高純度的EMSCs，見圖1。

2.2 MTT法檢測兩組EMSCs增殖情況 ?細胞接種后，CPC材料組和對照組隨在前5 d內保持正常的增殖速度，兩者之間無明顯差異，第7天開始可見明顯的促進作用，兩組比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3鬼筆環肽染色 ?分別于第3、7、14天后用鬼筆環肽染色液染色結果顯示，第3天EMSCs形態呈圓形，細胞形態未完全伸展，第7天EMSCs呈長梭型，第14天后EMSCs成堆生長，見圖2。

2.4堿性磷酸酶染色 ?兩組細胞成骨誘導第7、14天后行ALP染色，EMSCs堿性磷酸酶染色較深，ALP活性較強（第14天），見圖3。

2.5鈣結節染色 ?兩組EMSCs成骨誘導7 d后進行鈣結節染色，兩組EMSCs形成的鈣結節面積大小無明顯差別;14天后CPC組形成鈣結節面積明顯大于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2、圖4。

2.6免疫印跡結果 ?兩組EMSCs成骨誘導14 d，CPC材料組EMSCs表達Collagen I和osteocalcin高與對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見圖5。

3討論

臨床骨缺損的治療一直都是醫學上的難題，骨組織工程技術為解決這個問題提供了一種新的解決思路。理想的支架材料可以為種子細胞提供良好的生長繁殖及分化的微環境[7]。CPC是一種應用于臨床二十余年的植骨材料，具有良好的骨誘導性[8，9]。溫世鋒等[10]將人骨髓間充質干細胞接種在CPC表面，結果表面人間充質干細胞能夠在CPC表面附著增殖，并能向成骨細胞分化，證實了CPC的良好生物相容性。EMSCs是間充質干細胞的特殊類型，主要存在于頭面部粘膜的固有層，具有多向分化的潛能?？梢栽隗w外定向誘導分化為成骨細胞、神經樣細胞、少突膠質細胞、脂肪細胞等?？煞€定傳代至15代并保持良好的干細胞特性[11，12]。因此，本課題組將EMSCs與CPC混合培養，體外誘導分化，研究EMSCs復合CPC支架材料體外的成骨誘導及生物相容性。

本研究中，通過鬼筆環肽染色法動態觀察體外培養的EMSCs生長情況，14 d后發現EMSCs開始成堆聚集，表明EMSCs/CPC具有良好生物相容性。MTT法是檢測對比活細胞數的比較敏感的方法之一[13]。實驗的第7天可見CPC對EMSCs明顯的促進用;EMSCs/CPC組中ALP活性更強，茜素紅染色形成的鈣結節更大，并具有顯著統計學差異，表明CPC可促進EMSCs向成骨細胞分化。本課題組收取了成骨誘導14 d的兩組細胞蛋白，進行免疫印跡，檢測相關蛋白表達水平;collagen I和osteocalcin成骨細胞是研究骨代謝的生化標志物[14，15];免疫印跡數據顯示，EMSCs/CPC組表達collagen I和osteocalcin高于對照組（P<0.05），進一步明確了CPC對EMSCs體外誘導成骨的促進作用。

本研究結果證實了CPC對EMSCs的生長繁殖，分化具有明顯的促進用。CPC與EMSCs具有良好的生物相容性。然而，目前對于EMSCs/CPC復合支架的研究僅限于體外實驗，相較于體內實驗的影響因子多樣化，相關的數據及研究結果具有一定的局限性，還需進一步的體內實驗進行證實。

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收稿日期：2020-08-25;修回日期：2020-09-10

編輯/肖婷婷