微衛(wèi)星DNA標(biāo)記評(píng)估湛江光裸星蟲養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性

姚澤彬 姚維 彭錦勝 王慶恒 郭昱嵩

摘? ?要? ?為評(píng)估湛江地區(qū)光裸星蟲養(yǎng)殖群體的種質(zhì)現(xiàn)狀，利用11對(duì)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物對(duì)光裸星蟲的1個(gè)野生群體和2個(gè)養(yǎng)殖群體，每個(gè)群體取30～31個(gè)樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，11 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在不同群體呈現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性，野生群體和2個(gè)養(yǎng)殖群體的平均等位基因數(shù)（Na）在4.182～4.636，平均有效等位基因數(shù)（Ne）在2.447～2.632，平均觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）分別在0.442～0.471、0.525～0.536，平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.461～0.475。Hardy-Weinber 平衡分析顯示，3 個(gè)群體的大部分位點(diǎn)未偏離平衡。在每個(gè)群體中進(jìn)行連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)有4對(duì)位點(diǎn)間顯著（P<0.05）或者極顯著（P<0.01）偏離連鎖平衡。分子方差分析（AMOVA）顯示，光裸星蟲大部分的變異來自于群體內(nèi)而非群體間。綜合分析認(rèn)為，本研究采集的2個(gè)光裸星蟲養(yǎng)殖群體遺傳多樣性豐富，暫未出現(xiàn)近交衰退現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞? ?光裸星蟲;遺傳多樣性;微衛(wèi)星標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S932? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.31.001

光裸星蟲（Sipunculus nudus L.，1766），隸屬于方格星蟲綱（Sipunculidea）方格星蟲目（Sipunculiformes）方格星蟲科（Sipunculidae）方格星蟲屬（Sipunculus），俗稱“沙蟲”，生長(zhǎng)于溫帶及熱帶水域的潮間帶，以沙粒間的底棲藻類、有機(jī)碎屑等為食，在中國(guó)沿海均有分布。光裸星蟲營(yíng)養(yǎng)成分豐富，味道鮮美，高蛋白、低脂肪，具有較高的食用價(jià)值[1]，但自然采捕難度大，且過度采捕、海區(qū)污染、灘涂破壞等威脅光裸星蟲的種質(zhì)資源[2]，自然采捕已經(jīng)難以滿足市場(chǎng)的長(zhǎng)期需求。近年，光裸星蟲的人工養(yǎng)殖日益成熟[3-7]，然而，養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展常會(huì)因無序引種、苗種異地交易等導(dǎo)致種質(zhì)資源混雜，進(jìn)而影響遺傳多樣性的長(zhǎng)期穩(wěn)定。因此，有必要對(duì)人工養(yǎng)殖光裸星蟲的遺傳多樣性進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)估。

光裸星蟲的遺傳多樣性研究目前主要集中在對(duì)分子標(biāo)記和線粒體DNA的應(yīng)用上，王慶恒等運(yùn)用RAPD技術(shù)對(duì)4個(gè)光裸星蟲地理群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同地理群體存在較大的遺傳分化[8]。郭昱嵩等利用微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記分析了北部灣3個(gè)光裸星蟲地理群體的遺傳多樣性，得出“群體間存在較大的基因流、已產(chǎn)生較低水平的遺傳分化”的結(jié)論[9]。Du等利用線粒體COⅠ序列分析了3個(gè)地理野生群體的遺傳多樣性差異，認(rèn)為光裸星蟲目前具有較高的遺傳多樣性和獨(dú)特的種群結(jié)構(gòu)[10]。彭銀輝等基于線粒體控制區(qū)序列開展了6個(gè)地理野生群體光裸方格星蟲的遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)遺傳分化在群體間并不顯著，光裸方格星蟲具有較高的遺傳多樣性，且不同地理群體存在頻繁的基因交流[11]。周于娜等利用線粒體控制區(qū)序列分析了光裸星蟲不同地理野生群體和不同地理養(yǎng)殖群體的遺傳差異情況，認(rèn)為養(yǎng)殖群體光裸星蟲的遺傳多樣性略低于野生群體，養(yǎng)殖群體正在逐漸積累遺傳變異[12]。

微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR，simple sequence repeat），是1～6個(gè)堿基串聯(lián)重復(fù)序列。SSR標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富、引物通用性較好和共顯性遺傳等特點(diǎn)，是研究群體遺傳學(xué)的常用手段。目前，運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記研究光裸星蟲遺傳多樣性的報(bào)道較少。

本研究運(yùn)用科研團(tuán)隊(duì)自主開發(fā)的SSR標(biāo)記，篩選出多態(tài)性高的標(biāo)記對(duì)光裸星蟲3個(gè)群體的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)，并以野生群體作為參考群體來評(píng)估養(yǎng)殖光裸星蟲的遺傳多樣性，從而為光裸星蟲種質(zhì)資源保護(hù)和合理利用提供參考依據(jù)，還可為養(yǎng)殖光裸星蟲的種苗優(yōu)劣評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及DNA提取

實(shí)驗(yàn)用野生光裸星蟲采集自湛江遂溪縣下六鎮(zhèn)（遂溪野生群體，SX）的自然灘涂。2個(gè)湛江養(yǎng)殖群體分別采集自湛江碧海灣水產(chǎn)有限公司樂民繁育基地（樂民養(yǎng)殖群體，LM）和廣東海洋大學(xué)覃斗（覃斗養(yǎng)殖群體，TD）試驗(yàn)基地。參照文獻(xiàn)[13]的苯酚/氯仿抽提法，稍作修改后用于提取光裸星蟲基因組DNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用凝膠成像儀進(jìn)行觀察，估算DNA的濃度和純度。

1.2 微衛(wèi)星序列的引物篩選

本實(shí)驗(yàn)中項(xiàng)目組自主開發(fā)20對(duì)光裸星蟲微衛(wèi)星引物[14]，委托上海生工生物工程有限公司合成。將合成好的微衛(wèi)星引物進(jìn)行群體初篩選，篩選實(shí)驗(yàn)用20個(gè)隨機(jī)個(gè)體，提取DNA后對(duì)所有引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，根據(jù)預(yù)擴(kuò)增的結(jié)果篩選出11對(duì)多態(tài)性引物（見表1）。預(yù)擴(kuò)增體系與程序如下：PCR預(yù)擴(kuò)增總體系為10 μL，包含DNA模板0.5 μL，上下游引物（5 μmol·L-1）各0.5 μL，PCR Mix 5 μL，剩余體積用ddH2O 補(bǔ)齊至10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性80 s;94 ℃

30 s，退火（溫度依據(jù)引物而定）30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，銀染顯色，以出現(xiàn)清晰主帶為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出多態(tài)性引物和每對(duì)引物最適退火溫度，等位基因大小以 20 bp DNA Ladder Marker為參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.3 PCR擴(kuò)增及微衛(wèi)星檢測(cè)

委托上海生工生物工程有限公司合成熒光引物，用于光裸星蟲3個(gè)群體樣本的擴(kuò)增，每個(gè)群體30～32個(gè)個(gè)體。

PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包含DNA模板2 μL，上下游引物（5 μmol·L-1）各1 μL，Taq酶0.125 μL，10×PCR Buffer（含Mg2+） 2.5 μL，dNTPs （2.2 mmol·L-1） 2 μL，剩余體積用ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記隨機(jī)抽取4個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后放入凝膠成像儀中觀察，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否正常。將檢測(cè)到無異常的PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，檢測(cè)儀器為3730XL序列分析儀（ABI公司，美國(guó)）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用GenAlEx 6.503軟件對(duì)生物公司反饋的基因片段長(zhǎng)度等數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳分析，計(jì)算11個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（Ne）、等位基因數(shù)（Na） 、期望雜合度（He）、觀測(cè)雜合度（Ho）、Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)、固定指數(shù)（Fis）、群體間遺傳距離（DA）、遺傳相似系數(shù)（I）和分子方差分析（AMOVA）。利用PIC-CAL0.6軟件計(jì)算每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）。利用PopGen32軟件對(duì)每個(gè)群體的連鎖不平衡進(jìn)行檢測(cè)。無效等位基因用Micro-checker軟件進(jìn)行分析。群體間基于Nei's遺傳距離的聚類樹使用MEGA-X軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星引物的篩選

篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)有11個(gè)，其余9個(gè)為單態(tài)位點(diǎn)。所篩選出來的11對(duì)多態(tài)性引物的特征見表1。

2.2 等位基因數(shù)和有效等位基因數(shù)

3個(gè)光裸星蟲群體的11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均表現(xiàn)出多態(tài)性，由表2可知，3個(gè)群體中，遂溪野生群體的平均Na和平均Ne均最低，為4.182個(gè)和2.447個(gè);樂民養(yǎng)殖群體的平均Na最高，為4.636個(gè);覃斗養(yǎng)殖群體的平均Ne最高，為2.632個(gè)。

2.3 遺傳雜合度、Hardy-Weinberg平衡與連鎖不平衡

表2數(shù)據(jù)顯示，3個(gè)群體的平均觀測(cè)雜合度Ho和期望雜合度He的范圍分別在0.442～0.471和0.525～0.536，其中，平均Ho遂溪野生群體最大，為0.471，樂民養(yǎng)殖群體最小，為0.442;覃斗養(yǎng)殖群體的平均He在3個(gè)群體中最大，為0.536，另外2個(gè)群體的平均He均為0.525。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗(yàn)，在3個(gè)群體11個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)中大部分未偏離平衡狀態(tài)（P>0.05），每個(gè)群體均有4個(gè)位點(diǎn)偏離平衡狀態(tài)（P<0.05），其中Snu06、Snu07和Snu20位點(diǎn)在3個(gè)群體中均偏離平衡，Snu05位點(diǎn)在2個(gè)養(yǎng)殖群體偏離平衡狀態(tài)，Snu19位點(diǎn)在野生群體偏離平衡。在每個(gè)群體中進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果表明4對(duì)位點(diǎn)間顯著（P<0.05）或者極顯著（P<0.01）偏離連鎖平衡;在樂民養(yǎng)殖群體中有2對(duì)連鎖不平衡（Snu05/Snu19、Snu07/Snu13），野生群體和覃斗養(yǎng)殖群體均只出現(xiàn)1對(duì)相同的連鎖不平衡（Snu7/Snu19）。

2.4 多態(tài)信息含量（PIC）與無效等位基因

3個(gè)群體11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均PIC在0.461～0.475，遂溪野生群體最小，2個(gè)養(yǎng)殖群體相對(duì)較大。Micro-checker檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Snu07、Snu19和Snu20位點(diǎn)在3個(gè)群體中均存在無效等位基因，Snu05位點(diǎn)在2個(gè)養(yǎng)殖群體中存在無效等位基因，其余位點(diǎn)在各個(gè)群體中均不存在無效等位基因。

2.5 群體間遺傳分化分析

利用GenAlEx 6.503軟件計(jì)算得到了3個(gè)群體間的Nei遺傳距離（DA）和遺傳相似系數(shù)（I）（見表3）。樂民養(yǎng)殖群體和覃斗養(yǎng)殖群體間的DA最大，I最小;遂溪野生群體和覃斗養(yǎng)殖群體間的DA最小，I最大。3個(gè)群體間的DA為0.020～0.034。根據(jù)Nei遺傳距離采用鄰接法和UPGMA 法對(duì)3個(gè)群體進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示遂溪野生群體和樂民養(yǎng)殖群體聚為一支，覃斗養(yǎng)殖群體為一支（見圖1，僅列出鄰接圖）。

種群的遺傳分化系數(shù)（Fst）表明種群遺傳分化的水平，F(xiàn)st在0～0.05表明種群遺傳分化很弱，F(xiàn)st在0.05～0.15表明種群遺傳分化處于中等水平，F(xiàn)st在0.15～0.25表明種群遺傳分化較大，F(xiàn)st大于0.25表明種群遺傳分化很大。本研究中方格星蟲3個(gè)群體的Fst在0.008～0.012，均不顯著。AMOVA分析表明，99%的遺傳變異源于群體內(nèi)，群體間的遺傳變異僅占1%（見表4）。

3 討論

遺傳雜合度（H）是指微衛(wèi)星位點(diǎn)為雜合子的比例，可反映各群體在多個(gè)位點(diǎn)上的遺傳變異，是描述群體遺傳變異的一個(gè)重要指標(biāo)。群體H高，表明該群體的遺傳變異多，群體遺傳多樣性高[15]。郭昱嵩等在2012年報(bào)道了北部灣三個(gè)光裸星蟲野生群體的遺傳多樣性[9]，我們用與該研究相同的11個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)其平均雜合度進(jìn)行矯正，得到湛江烏石群體的平均Ho、平均He分別為0.458、0.500，北海山口群體的平均Ho、平均He分別為0.471、0.484，越南錦普群體的平均Ho、平均He分別為0.484、0.532。矯正后的數(shù)據(jù)，本研究遂溪野生群體的平均Ho和平均He略高于郭昱嵩等報(bào)道的湛江烏石野生群體，2個(gè)養(yǎng)殖群體的平均Ho和平均He除了樂民群體的平均Ho低于烏石群體外，其他均略高于烏石群體，但差異很小，這表明光裸星蟲遂溪群體的遺傳變異程度目前仍處于較高水平。

多態(tài)信息含量（PIC）反映了微衛(wèi)星標(biāo)記所包含的遺傳信息含量。在一個(gè)群體中該雜合子的比例越大，PIC值越大，該雜合子提供的遺傳信息越多。根據(jù)Botstein等[16]提出的標(biāo)準(zhǔn)，本研究的11個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中有4個(gè)高度多態(tài)性位點(diǎn)（PIC>0.5）、6個(gè)中度多態(tài)性位點(diǎn)（0.25

遺傳距離（DA）的大小可以用來確定群體之間的親緣關(guān)系，群體間的DA與親緣關(guān)系呈正比，與遺傳相似度（I）呈反比。DA越大，表明群體間的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，I越小;反之亦然[17]。本研究采用11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)3個(gè)光裸星蟲群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，根據(jù)Nei's指數(shù)法對(duì)光裸星蟲3個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示遂溪野生群體和覃斗養(yǎng)殖群體之間的I最大（0.980）、DA最小（0.020），鄰接法和UPGMA法聚類分析為一支。遺傳分化指數(shù)（Fst）是指群體內(nèi)的變異位點(diǎn)在群體位點(diǎn)中所占的比值，比值越大，群體遺傳分化程度越高，本研究中光裸星蟲3個(gè)群體間的Fst值在0.008～0.012，均小于0.05，3個(gè)群體均分化較小[18]，這可能與養(yǎng)殖群體為遂溪野生群體繁育的后代有關(guān)。AMOVA分析表明，群體間的變異僅1%，提示群體內(nèi)的遺傳變異是引起種群總體變異的主要因素。這與光裸星蟲海球幼體時(shí)期浮游生活相吻合，因?yàn)檫@增加了群體間的基因交流，導(dǎo)致群體間的變異程度遠(yuǎn)不如群體內(nèi)部。總的來說，光裸星蟲養(yǎng)殖群體和野生群體之間分化很小，養(yǎng)殖群體暫未出現(xiàn)明顯的退化，這與周于娜等[12]報(bào)道的結(jié)果相似。

整體而言，本研究篩選的11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性，適用于3個(gè)光裸星蟲群體的遺傳多樣性研究。研究結(jié)果表明遂溪野生群體與2個(gè)養(yǎng)殖群體的各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)之間總體上差異不大，群體間分化水平較低，光裸星蟲養(yǎng)殖群體暫未出現(xiàn)明顯的退化現(xiàn)象，這與現(xiàn)階段光裸星蟲大群體親本育苗、沙蟲苗養(yǎng)殖群體沙灘放養(yǎng)等養(yǎng)殖模式吻合。但是，近年來海洋環(huán)境污染特別是海灘垃圾污染導(dǎo)致的灘涂破壞有加重趨勢(shì)[19-21]，加上人為無序引種、苗種異地交易等，可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致光裸星蟲資源的遺傳多樣性水平下降，因此保護(hù)光裸星蟲種質(zhì)資源已經(jīng)刻不容緩。我們認(rèn)為只有加強(qiáng)對(duì)海洋垃圾源頭的控制，定期檢測(cè)光裸星蟲資源的遺傳多樣性水平，同時(shí)推廣科學(xué)合理的養(yǎng)殖模式，才能保護(hù)好光裸星蟲資源，達(dá)到星蟲資源的可持續(xù)利用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 羅少杰，楊創(chuàng)業(yè)，王慶恒，等.光裸星蟲4個(gè)野生群體的營(yíng)養(yǎng)成分分析與品質(zhì)評(píng)價(jià)[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36（1）：25-30.

[2] 王紅勇.海南沿海光裸方格星蟲生態(tài)習(xí)性及其資源保護(hù)[J].河北漁業(yè)，2014（10）：16.

[3] 蔣艷，蔡德建，鄒杰，等.方格星蟲苗種池塘中間培育試驗(yàn)研究[J].廣西科學(xué)，2010，17（2）：175-177.

[4] 鄒杰，彭慧婧，蔣艷，等.方格星蟲親體培育試驗(yàn)[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2010，37（3）：30-33.

[5] 文雪，蔣艷，鄒杰，等.方格星蟲灘涂人工養(yǎng)殖試驗(yàn)[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2011（1）：38-39.

[6] 陳振國(guó)，班庭輝，陳振華，等.方格星蟲土池育苗技術(shù)規(guī)程[J].海洋與漁業(yè)，2015（8）：64-65.

[7] 王慶恒，鄧岳文，張家煒，等.一種光裸星蟲室內(nèi)苗種培育的方法：CN106035246A[P].2019.

[8] 王慶恒，杜曉東，李康.光裸星蟲遺傳多樣性的RAPD分析[J].海洋水產(chǎn)研究，2006（3）：57-61.

[9] 郭昱嵩，王慶恒，黎幸連，等.北部灣光裸星蟲3個(gè)地理群體遺傳多樣性[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2012，19（1）：62-69.

[10] Du X， Chen Z， Deng Y， et al. Comparative Analysis of Genetic Diversity and Population Structure of Sipunculus nudus as Revealed by Mitochondrial COI Sequences[J]. Biochemical Genetics， 2009，

47（11-12）：884-891.

[11] 彭銀輝，周于娜，劉旭佳，等.基于線粒體控制區(qū)序列的光裸方格星蟲群體遺傳多樣性分析 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2017，41（10）：1542-1551.

[12] 周于娜，彭銀輝，劉旭佳，等.光裸方格星蟲野生與養(yǎng)殖群體線粒體控制區(qū)序列的遺傳差異分析[J].水生生物學(xué)報(bào)，2017，41（2）：384-390.

[13] Sambrock J， Russel DW. Molecular Cloning： a Laboratory Manual （3rd Edition）[M]. NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2002： 461-471.

[14] Wang Qingheng， Guo Yusong， Wang Zhongduo， et al. Isolation and Characterization of Microsatellite DNA Loci From the Peanut Worm， Sipunculus nudus[J]. Genetics and Molecular Research： Gmr， 2012， 11（2）： 1662-1665.

[15] 劉楚吾，黎錦明，劉麗，等.中國(guó)龍蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及遺傳多樣性分析[J].遺傳，2010，32（7）：737-743.

[16] Botstein D， White RL， Skolnick M， et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. Am Jhum Genet， 1980， 32（3）： 314-331.

[17] 張愛兵，王正軍，譚聲江，等.分子生態(tài)學(xué)重要概念——遺傳距離及其測(cè)度的理論研究概況[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，22（6）：149-155.

[18] Balloux F， Lugon-moulin N. The Estimation of Population Differentiation with Microsatellite Markers[J]. Molecular Ecology， 2002， 11（2）： 155-165.

[19] 黎樹式，林俊良，黃鵠，等.廣西海灘侵蝕原因與修復(fù)[J].北部灣大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，34（12）：30-37.

[20] 莫珍妮，曹慶先，陳圓，等.廣西沿海典型海灘海洋垃圾調(diào)查研究初探[J].化學(xué)工程與裝備，2018（7）：299-301.

[21] 趙肖，綦世斌，廖巖，等.我國(guó)海灘垃圾污染現(xiàn)狀及控制對(duì)策[J].環(huán)境科學(xué)研究，2016，29（10）：1560-1566.

（責(zé)任編輯：丁志祥）