口蹄疫O型液相阻斷ELISA免疫抗體檢測方法的運用

口蹄疫是一種發生在偶蹄動物中的疾病，是由口蹄疫病毒誘發的急性、熱性、高度接觸性傳染性，血清型以O型與A型分布較廣泛，危害性最大[1]。本次試驗研究主要采用液相阻斷ELISA法追蹤檢測某牧場O型口蹄疫免疫抗體滴度，希望對O性口蹄疫預防工作的開展提供更科學的指導。

1 材料和方法

1.1 樣品某牧場牛群均接受口蹄疫O型滅活疫苗（JYBL-2014-5-21）免疫后的1200份奶牛血清樣品。

1.2 器材酶標儀、恒溫溫箱、(5～50μl)移液器及器配套設施、微量抗原抗體反應板、ELISA試劑盒（中國農科院蘭州獸醫研究所）。

1.3 試驗流程

1.3.1 奶牛免疫嚴格依照產品說明書上設定的免疫劑量與方法，對本牧場奶牛接種口蹄疫F型滅活疫苗，在2免3周后采血并檢測免疫效果。

1.3.2 抗原抗體反應于96孔U 型微量血凝板上進行檢測，以10份樣品為例，需要使用2塊板，血清采用倍比稀釋方法進行（空白孔未加入樣品）。

在U型反應板上，利用50μL/孔的量PBST 2倍稀釋血清，被檢血清于第1～10列由1∶8稀釋到1∶128，于第11列稀釋陽性對照血清，由1∶2稀釋到1∶256；A12～B12孔稀釋陰性對照血清，由1∶2稀釋到1∶4。

使用PBST稀釋液將口蹄疫O型病毒抗原稀釋到工作濃度，血凝板檢測樣品血清與陰陽性血清（50μL/孔），加入等量工作濃度的病毒抗原以后，血清稀釋度加倍，封板，37℃溫育90min。

將抗原抗體混合液從U型反應板上按次序轉移至已包被口蹄疫O型免抗的ELISA板上，50uL/孔，封板，37℃溫育60min。

用PBST連續洗板3～5次，拍干，按50uL/孔加口蹄疫O型豚鼠抗體工作液（紅色），封板，37℃溫育30min。

網上洗板3～5次，拍干。將TMB底物A溶液和B溶液以1∶1比例混勻，加入混勻后的底物溶液50uL/孔，置37℃顯色15min。

顯色反應結束后，加終止液50uL/孔，終止反應，在酶標儀上讀取D450nm值。

洗酶標板等在37℃恒溫箱中培育15min以后，將每個孔洞內加入50uL終止液終止反應，于酶標儀上讀取D492mm值。

1.4 結果判斷將病毒抗原對照評價D492mm值的50.0%設為臨界值，被檢血清稀釋孔D492mm值大于臨界值的孔定義為陰性孔，反之為陽性孔。

2 結果

2.1 病毒抗原對照D492mm值1200份被檢樣品，共使用60個ELISA板，240個病毒抗原對照D492mm值區間為1.0～2.0。

2.2 免疫抗體效果對本牧場奶牛進行2免3周后檢測蹄疫O型滅活疫苗免疫抗體，共采血檢測1200份血樣，ELISA抗體效價≥1∶128。1178份判斷為O型口蹄疫抗體陽性，保護為98.17%；ELISA抗體效價1∶64～1∶128擇抗體滴度，取中間值1∶90，則判斷為可疑，50.0%以上保護。免疫抗體滴度＜1∶64的樣品有21份，判斷為O型口蹄疫抗體陰性，無需予以保護。

3 討論

在檢測口蹄疫過程中，獸醫臨床上主要采用無生物安全要求的血清學診斷技術，常見用的有液相阻斷ELISA、間接血凝試驗，其多用于動物疫苗免疫抗體監測領域中，功能是評估疫苗免疫動物持有的抗體水平。合理使用口蹄疫免疫檢測技術，能為口蹄疫綜合防治提供更可靠的技術支持。

液相阻斷ELISA具有高敏感性（基本上達到了100.0%），特異性偏高（約96.0%），并且重復性優良，檢測速度更快，在大批量血清樣品檢測領域中表現出較高適用性，能更確切的評估疫苗免疫效能[2]。

本次試驗分析中采用代號JYBL-2014-5-21的口蹄疫O型滅活疫苗抗體效價去檢測提供較可靠的試驗數據，其能更有效、科學的指導牧場O型口蹄疫防疫工作，為疫病預防提供更可靠依據。本次試驗研究結果表明，抗體效價保護率約為98.17%。