Twinfilin-1基因對H9C2心肌細胞凋亡和增殖的影響

艾克熱木·吐爾遜

心肌細胞凋亡、損傷是引起心血管功能異常及相關疾病的重要始動因素之一，其與心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病關系密切[1]。Twinfilin-1(Twf-1)基因是一類細胞骨架調控蛋白，主要參與調控細胞內彈性纖維的長度與排列[2]。在心肌細胞中，細胞骨架不僅參與維持細胞形態，為細胞中細胞器的定位提供支持，并且參與細胞蛋白合成以及營養物質的運輸[3-4]。目前研究表明細胞骨架在心肌梗死、心力衰竭、心肌肥厚等心血管疾病過程中發揮了重要作用。探討心肌細胞中Twf-1基因的表達及其對心肌細胞增殖與凋亡的影響，對于明確心肌細胞凋亡機制具有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 H9C2心肌細胞購于ATCC(American type culture collection)。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12培養基、胰蛋白酶、胎牛血清(GIBCO公司)，TRIZOL、轉染試劑質體LTX、PI(Invitrogen公司)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液(Sigma公司)，SYBR Premix Ex Taq(TAKARA公司)，CCK8試劑盒(同仁)。Twf-1 RNAi慢病毒、pCXN2-Flag空質粒及 pCXN2-Flag-h Twf-1 過表達質粒均由深圳華大基因化學技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將H9C2 細胞置于含10%胎牛血清FBS的DMEM/F12培養基中，于5%二氧化碳、37 ℃條件下培養。取對數生長期細胞制成細胞懸液，接種于6孔板中，每孔約×105個細胞。

1.2.2 細胞轉染 當細胞密度達60%時更換新鮮培養基，分別進行空白對照試劑、陰性慢病毒試劑以及Twf-1 RNAi慢病毒試劑感染。24 h后更換新鮮培養基，并加入嘌呤霉素進行細胞篩選。待熒光顯微鏡下觀察見含綠色熒光標記細胞占細胞總量的80%以上時，將轉染Twf-1 RNAi慢病毒的心肌細胞分為3組，分別給予空白試劑、空質粒、過表達Twf-1質粒進行轉染，根據細胞轉染情況分為空白對照組、陰性對照組、Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質粒組、Twf-1沉默+過表達Twf-1組 5組。細胞轉染72 h后即可進行相關細胞生物學行為能力檢測。

1.2.3 熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)實驗 H9C2細胞總RNA提取按照RNAprepPureMicroKit說明操作，細胞總RNA采用Trizol法，用紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。按照miRNA反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄，參照SYBR?Premix Ex Taq TM試劑盒說明進行RT -PCR檢測，反應程序：95 ℃10 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，40個循環，所有試驗重復3次，采用相對定量分析按照2-△△Ct(實驗組)-△△CT(對照組)求出 Twf-1 表達水平。

1.2.4 細胞增殖實驗(CCK8) 收集各組轉染細胞接種于96孔板中，每孔3 000個，培養箱中常規培養，于72 h向每孔加入10 μL CCK8試劑，培養箱中放置2 h，隨后用酶標儀測定其在450 nm處的吸光度(A)值。

1.2.5 細胞凋亡實驗(流式細胞術) 分組干預72 h后，將各組細胞培養基分別轉移到15 mL的錐形管中并置于冰上。用2 mL PBS 溶液輕輕潤洗培養板內細胞，去除PBS溶液，加0.5 mL 0.25%不含EDTA胰酶孵育，直到顯微鏡下觀察到細胞開始從培養板壁脫落。輕輕連續拍打使細胞從培養板壁上完全脫落，將細胞輕輕重懸于預冷緩沖液中制成1×106/mL細胞懸液，取0.5 mL細胞懸液轉移至干凈離心管內，加入1.25 μL細胞凋亡檢測試劑 Annexin V-FITC。室溫避光反應15 min后離心，去除上清，將細胞用0.5 mL預冷的結合緩沖液輕懸，加入10 μL PI，立即使用流式細胞儀檢測分析。

2 結 果

2.1 H9C2心肌細胞慢病毒感染情況 對慢病毒載體進行熒光蛋白和嘌呤霉素雙標記，慢病毒轉染48 h后，在熒光顯微鏡下可見，空白對照組無綠色熒光標記，陰性對照組80%以上細胞有綠色熒光標記，Twf-1沉默組85%以上細胞有綠色熒光標記。詳見圖1。

圖1 H9C2心肌細胞慢病毒感染情況(×100)

2.2 各組心肌細胞Twf-1基因表達水平比較 RT-PCR結果顯示，進行慢病毒轉染后，與空白對照組和陰性對照組相比，Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質粒組心肌細胞中Twf-1基因的表達水平均明顯降低(P<0.05)，Twf-1沉默+過表達Twf-1組心肌細胞中Twf-1基因的表達水平則明顯增加，組間差異有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2。

與空白對照組比較，＊P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

2.3 各組心肌細胞增殖情況比較 CCK8細胞增殖實驗結果顯示，轉染慢病毒后，與空白對照組和陰性對照組相比，Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質粒組心肌細胞增殖效率均明顯降低(P<0.05)，Twf-1沉默+過表達Twf-1組心肌細胞增殖效率則明顯升高，組間差異具有統計學意義(P<0.05)。詳見圖3。

與空白對照組比較，＊P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05。

2.4 各組心肌細胞凋亡率情況比較 流式細胞凋亡實驗結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質粒組心肌細胞凋亡率均明顯增加(P<0.05)，Twf-1沉默+過表達Twf-1組心肌細胞凋亡率與空白對照組和陰性對照組比較差異無統計學意義，且與Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質粒組相比則明顯降低，組間差異具有統計學意義(P<0.05)。詳見圖4、圖5。

與空白對照組比較，＊P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05；與Twf-1沉默組比較， △P<0.05；與Twf-1沉默+空質粒組比較，☆P<0.05。

圖5 各組心肌細胞凋亡實驗結果分析

3 討 論

心肌細胞凋亡是引起各種慢性心力衰竭、心臟功能惡化的主要因素之一，心肌細胞凋亡是貫穿整個心血管疾病發病過程的重要環節，尋找抑制心肌細胞凋亡的途徑及相關分子作用機制至關重要[5]。

Twf-1基因屬于肌動蛋白結合蛋白家族成員之一，在除植物細胞以外的所有真核細胞中普遍存在[6]。Twf-1基因主要參與細胞骨架的重塑，在肌動蛋白纖維的極向生長中發揮著重要的介導作用[7]。作為一個重要的骨架調節蛋白，Twf-1基因不僅與心肌細胞遷移、增殖等動態運動有關，還與某些細胞結構形成以及細胞凋亡等生理病理過程有關。研究指出，Twf-1基因可與某些肌動蛋白單體結合，通過與加帽蛋白的相互作用，參與profilin蛋白的腺苷酸化及聚合反應，由此參與完成肌動蛋白纖維的極向生長[8-9]。研究指出，在細胞骨架重塑過程中，Twf-1基因主要參與調節肌動蛋白單體的動態循環[6，10]?，F已有研究明確指出，Twf-1基因與心肌肥大病理生理過程密切相關，但具體作用機制尚未完全明確[11-12]。有文獻報道指出，采用siRNA干擾技術沉默Twf-1基因的表達可明顯抑制肌動蛋白纖維絲的形成，從而減弱腫瘤細胞向遠處遷移的能力，降低瘤細胞的侵襲性，提示Twf-1基因在腫瘤細胞的發生發展中扮演著重要角色[13-14]。

本研究利用siRNA干擾技術，對H9C2心肌細胞中Twf-1基因的表達水平進行了下調，并通過構建相關質粒對H9C2心肌細胞中Twf-1基因進行過表達，實驗結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質粒組心肌細胞中Twf-1基因的表達水平明顯降低(P<0.05)，Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質粒組心肌細胞增殖率明顯降低(P<0.05)，這兩組心肌細胞凋亡率則明顯增加(P<0.05)。且與空白對照組和陰性對照組相比，Twf-1沉默+過表達Twf-1組心肌細胞中Twf-1基因的表達水平及細胞增殖率也均明顯增加(P<0.05)，其心肌細胞凋亡率與空白對照組和陰性對照組相比無統計學意義，但Twf-1沉默+過表達Twf-1組心肌細胞與Twf-1沉默組、Twf-1沉默+空質粒組相比其凋亡率則明顯降低，組間差異具有統計學意義(P<0.05)。提示siRNA可靶向沉默Twf-1基因，同時抑制心肌細胞增殖，促進心肌細胞凋亡，構建pCXN2-Flag-h Twf-1 過表達質粒則可逆轉Twf-1 siRNA對心肌細胞中Twf-1表達水平及相關生物學行為能力的影響。

綜上所述，沉默Twf-1基因可抑制H9C2心肌細胞增殖，促進細胞凋亡；過表達Twf-1基因則可促進H9C2心肌細胞增殖，抑制細胞凋亡。后續實驗將進一步探究Twf-1具體的上下游靶基因，對心血管疾病潛在治療靶點Twf-1的具體作用機制進行深入探討。