結節性硬化病人臨床表型及遺傳學分析

陳 健，王建斌，郝曉燕，孫海瑞，何怡華

結節性硬化(tuberous sclerosis complex，TSC)是一種常染色體顯性遺傳疾病，其在正常人群中的發病率為1/6 000～1/10 000[1-2]。TSC病人的臨床表型和癥狀往往差別較大，最常見的臨床表現包括智力障礙、孤獨癥或癲癇等中樞神經系統癥狀，其主要由皮質及室管膜下病變引起，少數由未分化的巨細胞瘤引起[3-5]。累及多系統的錯構瘤形成則是另一種主要表現，可見于皮膚、肝臟、腎臟、肺部[6]。大多數情況下，病人都是因為明顯的皮膚癥狀或癲癇前來就診。傳統的TSC診斷標準主要以臨床表型為基礎，對于臨床表型不典型的病人診斷常較困難。2012年修訂的TSC診斷標準將TSC1和TSC2基因的致病突變作為一項單獨的TSC基因診斷標準[7]，上述兩個基因分別位于9q34和16p13.3，9q34包含23個外顯子，16p13.3包含41個外顯子[8]。這兩個基因均為腫瘤抑制基因，分別編碼形成錯構瘤蛋白和馬鈴薯蛋白，并形成一個主要的雷帕霉素受體復合體1(the mammalian target of rapamycin，mTORC1)，控制細胞的增殖、分化、黏附生長和遷移，對于mTORC1的靶向治療成為目前研究的熱點[9]。除此之外，兩個基因還在大腦皮質分化和生長控制方面起著重要作用。在新近研究報道的TSC突變中，TSC新發突變的比例超過2/3[10]。

雖然越來越多的TSC基因突變被報道，但特定突變與特定表型之間的對應關系尚不清楚，常可見相同家系突變在親代和子代病人中的表型存在較大的差異[11]。本研究對42例臨床確診為TSC的病人進行家系臨床表型和遺傳學分析，探討不同突變與臨床表型之間可能的關聯。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究系一項前瞻性研究，經首都醫科大學附屬北京安貞醫院倫理委員會批準。通過與TSC中國協會合作，于2015年9月—2017年12月入組42例獨立的TSC病人及其家系，所有病人都被臨床確診為TSC。對所有病人及直系親屬進行了TSC1和TSC2目標基因檢測。經北京安貞醫院倫理委員會批準，所有接受基因檢測病人家系均需簽署知情同意，表示知曉本研究情況并同意接受基因檢測。

1.2 臨床表型采集 主要采集臨床表型包括面部血管纖維瘤或前額斑塊、非外傷性指(趾)甲或甲周纖維瘤、色素減退斑(≥3)、鯊革樣皮疹(結締組織痣)、多發性視網膜錯構瘤結節、皮質結節、室管膜下結節、室管膜下巨細胞星形細胞瘤、單個或多發的心臟橫紋肌瘤、肺淋巴管性肌瘤病、腎血管平滑肌瘤。所有病人的診斷均由一位有經驗的臨床醫生獨立完成。

本研究中所有病人臨床診斷依據2012年國際TSC大會修訂的TSC診斷標準，大多數先證者都有典型的皮膚和腦部病變[7，10]。所有病人都接受了高分辨率的腦部核磁(MRI)或電子計算機斷層掃描(CT)。所有病人癥狀及體征采集均由一位有經驗的醫生完成，且不知曉其基因突變結果。

1.3 DNA樣本采集 對家系先證者及其相關家系成員采集外周血樣，采集部位為外周靜脈，使用4 mL EDTA抗凝管，每人2管，冷藏保存運輸。所有樣本若不能立即送檢，則置于-20 ℃冰箱或-80 ℃液氮罐中保存。

1.4 TSC目標基因檢測 使用標準程序分別在組織、羊水及全血中提取DNA樣本。通過多重PCR和Illunina模塊順序擴增TSC1和TSC2外顯子。使用多重連接探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)檢測TSC目標基因大片段的重復或缺失。

DNA提取：使用BloodGen Midi Kit (CWBIO， China)提取病人DNA并進行質控，具體要求為：DNA濃度要求至少達到30～50 ng/μL，不能有降解，不能有RNA污染。

多重PCR方法構建文庫：定制羅氏NimbleGen捕獲探針進行目標基因全外顯子捕獲。使用同一PCR體系加上二對以上引物，產生多個核酸片段的PCR反應，完成DNA 文庫構建。文庫構建完成后，取1 μL捕獲文庫用于Qubit定量，然后適當稀釋文庫用Q-PCR檢測文庫濃度，以保證文庫質量并達到以下標準：濃度≥10 nm(qPCR定量濃度)；文庫檢測后剩余體積≥10 μL。

測序：將所取標準文庫樣本在Illumina hiseq2500平臺使用標準操作流程上機測序：選擇高通量模式——PE100 測序。測序得到圖像原始數據，應用Illumina官方basecall分析軟件BclToFastq得到原始數據，并進行原始數據去接頭質量過濾。數據分析：原始數據產量統計、比對、SNP檢測及注釋、Indel檢測及注釋、突變假陽性過濾、突變注釋等生物信息學分析。有疑似位點的樣本需要進行一代測序(Sanger法)驗證。

1.5 報告解讀 臨床醫生與生物信息專員共同對病人家系基因結果生物學信息、臨床表型、臨床癥狀及治療情況等進行匹配、個體化綜合分析，最終做出基于臨床基礎的基因診斷報告。

2 結 果

42例病人及家系都成功接受了家系基因檢測，其中39個家系中每個先證者中均檢測出單個TSC突變，其中2個突變分別在不同的病人中檢出2次和3次，合計共36個不同的致病或疑似致病性突變，包括14例無義突變，12例移碼突變，4例錯義突變， 2例剪接突變，4例大片段缺失；另外3個家系TSC目標基因檢測均為陰性(見表1)。在檢測出突變的39個家系中，新發突變為34個，家系遺傳突變為5個。

表1 42例病人TSC基因突變特征

2.1 TSC1突變情況 在本研究42個家系中，檢測出TSC1突變6例(14%)，其中5例為新發突變，1例家系遺傳突變。分別是3例無義突變，2例移碼突變，1例大片段缺失，均為致病性或疑似致病性突變，突變位置集中于8、9、11、14、18號外顯子(見表1、表2)。

表2 TSC1和TSC2基因突變情況 單位：例

2.2 TSC2突變情況 共有33個家系先證者檢測出TSC2突變(79%)，其中29例為新發突變，4例家系遺傳突變見表 1。包括11例無義突變，10例移碼突變，4例錯義突變，3例大片段缺失，2例剪接突變，所有突變均為致病性或疑似致病性突變。這些突變中所有點突變的位置集中于16個外顯子及1個內含子，其中累及次數最多的位置為41號外顯子，共有5個不同的先證者均被檢測出該位置致病突變；2個大片段缺失突變累及1～16號外顯子。

2.3 TSC表型特征 所有TSC癥狀及體征數目分布及其在不同基因型中的占比顯示，男性占多數，共31例(74%)。詳見表1。42例病人不同TSC表型特征與基因型分析見表3。在所有病人相關的TSC表型中，最常見的體征為腦部室管膜下結節(見圖1)，在39例病人中出現，占比93%，其次是皮膚色素減退斑(見圖2)，為38例(90%)；最常見癥狀為癲癇，出現病人38例(90%)，這也是大多數病人就醫的原因。皮膚癥狀和腦部組織是所有病人中最常見的表現，均在超過一半的病人中出現。

表3 42例病人不同TSC表型與基因型分析 單位：例(%)

圖1 腦部CT顯示患兒多發室管膜下結節(箭頭所示)

圖2 病人右側腰部皮膚多發白斑(箭頭所示)

3 討 論

本研究中被檢出攜帶TSC2基因突變的病人占大多數，但無論是TSC1和TSC2突變，經臨床確診的病人在表型上差別不大，如決定病人癥狀嚴重程度的重要指標——智力狀況，在TSC1突變病人中，僅有4例(4/6)出現了智力減退表現，而在TSC2病人中，有23例(70%)出現智力減低，這與既往報道并不一致[12-13]。本研究中TSC1病人較少可能是原因之一。在新發和家系遺傳突變比例上，TSC1基因和TSC2基因差別也不大，前者家系遺傳1例(1/6)，后者家系遺傳4例(12%)。

一些致病位點的較高頻率突變值得關注。TSC2基因41號外顯子被檢出5個致病或疑似致病突變，其中3個為已經有文獻報道證實致病的錯義突變，另外2個為移碼突變，雖未見報道，但生物信息分析結果為多個核苷酸的缺失會導致編碼蛋白質的改變，從而影響功能，高度疑似致病突變。5例病人均有較嚴重的TSC癥狀，所有病人都出現了癲癇發作，4例病人出現智力減低，并且出現癥狀相對較晚，平均診斷年齡為3歲。

兩個點突變在不同病人身上被重復檢出。其中點突變TSC2：c.3412C>T (Exon30)在3例不同病人身上被檢出，該突變可造成編碼蛋白的1 138位氨基酸由精氨酸(R，Arg)變異為終止密碼子(X)，且相對原來縮短670個氨基酸，因此，考慮為致病突變。除此之外，該突變也已經有相關疾病報道[14]。3例病人均在0～1歲出現首發癥狀癲癇，3例患兒均出現室管膜下結節和多發色素減退斑，其中2例出現智力減退表現。TSC2：c.5228C>T(exon41)則是另一個在2例不同病人身上被檢出的致病點突變，該位點的突變導致1 743位的氨基酸由精氨酸(R)變為谷氨酰胺(Q)，可以造成編碼蛋白序列的改變，對其結構和功能造成嚴重影響，已有文獻報道該致病位點上的相同類型氨基酸變異[15]。攜帶上述突變的兩例病人均出現較嚴重癥狀，包括癲癇、智力減低、室管膜下結節和皮質發育不良、皮膚多發色素減退斑，同時多發牙釉質改變和多發心臟橫紋肌瘤也分別見于其中1例病人。

本研究中共有3例病人及其家系TSC目標基因檢測結果為陰性，3例臨床癥狀及體征均相對較輕，其中2例患兒出現癲癇癥狀，但用藥后均明顯好轉；除1例患兒智力可疑減退外，另外2例患兒均無明顯智力減退表現。但由于此次檢測基因采樣位置為外周血，未排除嵌合體的可能[16]，目前正在進行下一步的多位置樣本采集，特別是病變部位。家系突變的比例在本研究中較少，僅有5例(12%)，其共同的特點是親代臨床表型較子代輕，特別是神經系統癥狀，親代都沒有明顯神經系統癥狀，智力也無明顯減退，而在子代中有4例先證者患兒出現神經系統癥狀和智力減退表現。同一位點突變在親代和子代之間的差別機制尚不明確。本研究是一項單中心的前瞻性研究，在42例臨床確診的TSC病人中檢測出36個不同的TSC1/2致病突變。無義突變和移碼突變是最常見的TSC致病突變。TSC2的致病突變在所有檢出突變中占大多數，但本研究中TSC1和TSC2基因突變的TSC病人在臨床表型上差異不明顯。3例(7%)病人常規外周血基因檢測陰性，這與既往報道相符，不能除外部分病人為體細胞或生殖細胞嵌合體的可能[16-17]。

本研究入組樣本量較少，部分TSC的癥狀和體征在本研究中并未發現。對于連續檢出的高頻突變，需要進一步的功能驗證明確證實其致病性。