角蛋白7在膀胱癌中的表達(dá)及與臨床預(yù)后的關(guān)系

徐長陽，劉敏，劉鵬，郎根強(qiáng)

膀胱癌屬于泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，大數(shù)據(jù)顯示，在危害人類健康全身惡性腫瘤中，男性膀胱癌發(fā)病率排在第7位，女性膀胱癌排在第10位之后[1]。臨床研究顯示，膀胱癌患者術(shù)后3年生存率為15%～30%，多數(shù)患者死于癌癥復(fù)發(fā)或癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2-3]。近年來，分子靶向治療取得快速的發(fā)展，尋找新的治療方向是臨床和學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)。細(xì)胞角蛋白(KRT)是一種中間絲，存在于許多上皮細(xì)胞或部分非上皮細(xì)胞。角蛋白7(keratin 7，KRT7)屬于細(xì)胞角蛋白家族，可參與細(xì)胞間連接的形成，維持上皮細(xì)胞的完整性[4]。有研究顯示，KRT7表達(dá)于導(dǎo)管上皮細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞、已分化的尿路上皮細(xì)胞，對腫瘤的預(yù)后評估具有一定的價(jià)值[5]。已有研究報(bào)道膀胱癌組織中KRT7表達(dá)水平明顯低于正常組織[6]。本研究采用免疫組化法檢測KRT7在膀胱癌組織中的表達(dá)及其與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系，旨在明確KRT7在膀胱癌中的作用及評估患者預(yù)后方面的價(jià)值，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年6月—2017年4月上海長海醫(yī)院虹口院區(qū)泌尿外科手術(shù)切除的100例膀胱癌患者組織標(biāo)本為研究對象，并選取相應(yīng)的距病灶組織3 cm處100份癌旁組織為對照組。男65例，女35例；年齡35～77(55.87±10.86)歲；病程8～24(16.04±4.46)月。膀胱癌的臨床表現(xiàn)為尿頻、尿急、尿痛、肉眼可見的間歇性血尿[7]。按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)的臨床TNM分期[8]：非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)54例，肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)46例；按照WHO病理分級[9]：低度惡性傾向14例，高分化33例，低分化53例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例；病理類型為膀胱尿路上皮癌40例，膀胱鱗狀上皮癌36例，膀胱腺癌24例；合并膀胱結(jié)石30例，合并排尿不暢26例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者及直系親屬對本研究知情同意，并簽訂臨床研究協(xié)議書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者術(shù)前未接受任何輔助性治療；②患者臨床資料完整，能夠接受術(shù)后隨訪；③患者為首次患膀胱癌。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝、腎功能異常患者；②并發(fā)其他惡性腫瘤、有膀胱癌家族遺傳史患者；③曾經(jīng)接受過放化療患者；④合并有其他泌尿系統(tǒng)疾病患者；⑤有吸煙、酗酒史。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 KRT7表達(dá)水平檢測：采用免疫組化法檢測組織中KRT7表達(dá)水平。標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后，采用RM2016型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國徠卡公司)連續(xù)切6片，厚度3～4 μm，編碼并烘干(60℃，2 h)。采用蘇木精淺染，自來水沖洗還藍(lán)，烘干后經(jīng)二甲苯脫蠟，依次用75%、85%、95%、無水乙醇進(jìn)行梯度洗脫、脫水干燥，加入鼠抗人KRT7抗體(上海鈺博生物科技有限公司)作為一抗，4℃冰箱過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，滴加羊抗鼠二抗(北京博爾西科技有限公司)，25℃孵育24 h，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染。最后用中性樹膠封固。SPCC-200型生物顯微鏡(東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司)下觀察攝片。PBS代替一抗作為空白對照。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由3位專業(yè)人員獨(dú)立判斷評定。KRT7表達(dá)于胞漿，陽性表達(dá)呈淺棕色或深棕色。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度，陽性強(qiáng)度評分：樣品無色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。任意選擇3個(gè)高倍(×200)光學(xué)顯微鏡下視野陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行計(jì)分，評分標(biāo)準(zhǔn)：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。根據(jù)染色指數(shù)(SI，即染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占比例的評分乘積)大小將免疫組化結(jié)果進(jìn)行等級劃分：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。其中陰性記為KRT7陰性，弱陽性、陽性和強(qiáng)陽性記為KRT7陽性。

1.3.2 隨訪情況：所有膀胱癌患者治療后均接受常規(guī)隨訪，隨訪時(shí)間36個(gè)月，術(shù)后第1年每隔3個(gè)月患者入院復(fù)查1次，術(shù)后第2、3年，每隔6個(gè)月患者入院復(fù)查1次，并每2個(gè)月電話隨訪患者，記錄膀胱癌患者復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移及生存死亡情況。本次隨訪截止日期2020年4月。

2 結(jié) 果

2.1 膀胱癌組織和癌旁組織KRT7表達(dá)水平比較 膀胱癌組織KRT7陽性表達(dá)率為67.0%(67/100)，低于癌旁組織的92.0%(92/100)(χ2=19.175，P=0.000)，見圖1。

2.2 膀胱癌不同臨床病理特征患者中KRT7表達(dá)水平比較 膀胱癌組織中KRT7表達(dá)水平在不同性別、年齡、病理類型中比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在不同TNM分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1 膀胱癌旁組織和膀胱癌組織KRT7表達(dá)情況(HE染色，×200)

2.3 膀胱癌組織KRT7陽性、陰性表達(dá)患者生存率比較 Kaplan-Meier法分析顯示，KRT7陽性膀胱癌患者平均生存時(shí)間為30.85個(gè)月，長于KRT7陰性膀胱癌患者(17.65個(gè)月)，Log-rank檢驗(yàn)值χ2=36.928，P=0.000，見圖2。

2.4 影響膀胱癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析 多因素分析結(jié)果表明，TNM分期MIBC、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KRT7陰性是影響膀胱癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，見表2。

圖2 膀胱癌組織KRT7不同表達(dá)水平患者生存率比較

表2 影響膀胱癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

3 討 論

膀胱癌以尿路上皮細(xì)胞癌最常見，占膀胱癌的90%以上。盡管生活水平及醫(yī)療水平均有所提高，但膀胱癌的發(fā)病率仍然逐年增加，且趨于年輕化[10-12]。臨床上大多數(shù)膀胱癌患者初診時(shí)為非肌層浸潤膀胱癌，在治療過程中，癌癥復(fù)發(fā)和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是影響膀胱癌預(yù)后的關(guān)鍵因素[13-14]。因此，為提高膀胱癌患者治愈率及生存率，及早監(jiān)測膀胱癌術(shù)后病情是有效的預(yù)防手段之一。

表1 KRT7表達(dá)水平在膀胱癌不同臨床病理特征中比較 [例(%)]

角蛋白家族包括Ⅰ型和Ⅱ型角蛋白，是上皮細(xì)胞中間絲的構(gòu)成蛋白，也是細(xì)胞骨架不可缺少的部分，在細(xì)胞中起著結(jié)締支持和保護(hù)的作用，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展[15-16]。在尿路上皮細(xì)胞癌變的過程中，角蛋白的表達(dá)通常較為保守。有研究顯示，角蛋白19可介導(dǎo)尿路上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化信號傳導(dǎo)通路[17]。KRT7位于12號染色體上，編碼469個(gè)氨基酸殘基，表達(dá)于上皮組織分化期異型角蛋白鏈，胞質(zhì)內(nèi)的KRT7與其他輔助蛋白結(jié)合后，在維護(hù)上皮細(xì)胞的形態(tài)完整性上具有重要作用。KRT7屬于小分子量角蛋白，在上皮細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)具有特異性[18]。已有文獻(xiàn)顯示，KRT7在宮頸上皮細(xì)胞中具有特異性表達(dá)[19]。KRT7能夠調(diào)控DNA復(fù)制、細(xì)胞周期及基因表達(dá)等[20]。腫瘤的發(fā)生是正常染色體多重?fù)p傷后發(fā)生的結(jié)果，包括抑癌基因的失活、原癌基因的過度激活、DNA轉(zhuǎn)錄失常等，由此推論KRT7可能參與腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)[21-23]。田向永等[6]研究發(fā)現(xiàn)，KRT7的水平隨腫瘤分期及病理分級的增高而降低，表明KRT7低表達(dá)可能有較高的膀胱癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織KRT7陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組織，提示KRT7可能與膀胱癌發(fā)生有關(guān)。膀胱癌主要按腫瘤浸潤深度來分期，也是膀胱癌預(yù)后的重要參考指標(biāo)，其中腫瘤生長未達(dá)到肌層的表淺膀胱癌，占膀胱癌的75%～85%，而肌層浸潤膀胱癌占15%～25%，膀胱癌的病理分級也是預(yù)后的重要指標(biāo)，其中高分化的癌細(xì)胞分化良好，侵襲性不強(qiáng)；低分化的癌細(xì)胞分化差，侵襲性較強(qiáng)，患者預(yù)后也較差。本研究發(fā)現(xiàn)，KRT7與TNM分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是通過調(diào)節(jié)機(jī)體染色體活性，從而影響膀胱癌患者病情。本研究術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，KRT7陽性膀胱癌患者平均生存時(shí)間顯著長于KRT7陰性膀胱癌患者，TNM分期MIBC、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KRT7陰性是影響膀胱癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示KRT7陰性患者可能易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)，對該部分患者在治療和術(shù)后恢復(fù)中應(yīng)給予更多的關(guān)注。

綜上所述，KRT7在膀胱癌組織中陽性表達(dá)率顯著降低，與患者TNM分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有望成為膀胱癌預(yù)后的監(jiān)測指標(biāo)，KRT7陰性表達(dá)者、TNM分期為MIBC和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，在臨床治療時(shí)應(yīng)更多注意患者的病情。但KRT7參與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

徐長陽：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；劉敏：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；劉鵬：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；郎根強(qiáng)：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析