金黃色葡萄球菌快速檢測方法研究進展

劉啟超 唐一通 劉雪妮 王夢曉 傅琴琴 肖娜

[摘 要]金黃色葡萄球菌是引起醫院感染和食物中毒的重要病原菌，建立和發展快速檢測方法對于該菌的診斷和防控具有重要意義。該文對基于免疫磁珠分離技術開展金黃色葡萄球菌快速檢測的方法進行了探究，是今后開展病原菌檢測的發展方向。

[關鍵詞]金黃色葡萄球菌;免疫磁珠;快速檢測

[中圖分類號] R155.5[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-9324（2020）47-0-03[收稿日期] 2020-05-31

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）廣泛分布于人的體表、上呼吸道等部位，是最常見的人體致病菌之一，其既可引起院內感染和社區獲得性感染，也是重要的食源性感染的病原菌[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的出現和迅速傳播，使得金黃色葡萄球菌的感染變得越來越難以治療，已成為抗感染治療的一大難題[2]。

目前，有多種基于細菌培養、分子生物學、免疫學以及生物傳感器等原理的金黃色葡萄球菌檢測方法。隨著免疫磁性微球技術在生物醫學領域的廣泛應用，基于免疫磁珠技術的病原菌快速檢測技術得到快速發展。免疫磁性分離技術是通過將抗原抗體等識別物包被在具有一定粒徑范圍的超順磁性納米磁珠上，利用磁珠的磁響應性對目標物進行富集分離的技術。因該技術操作簡單快速，特異性和靈敏度高，近些年在蛋白、核酸純化，細胞分離以及病原菌檢驗等領域有著廣泛應用。本文總結了基于免疫磁分離技術開展金黃色葡萄球菌快速檢測的方法。

一、免疫磁珠直接富集分離法

周莉等[3]利用羧基聚苯乙烯磁性微球、兔抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體對食品樣品中的金黃色葡萄球菌進行富集分離，具有較好的特異性和靈敏度。敏感性測定結果顯示，經免疫磁性微球富集和平板培養，可從細菌濃度為14cfu/mL的培養液中檢出金黃色葡萄球菌，靈敏度遠高于直接涂板計數方法。該方法可用于牛奶、醬油和速凍水餃等樣品中金葡菌的微量檢測。吳俊等[4]利用直徑20nm的裸磁珠對培養液中的金黃色葡萄球菌具有較好的吸附能力，對濃度為102～107cfu/mL的培養液中的細菌吸附率可達95%以上，最大吸附量為6×108cfu/mg。磁珠吸附富集的菌體提取DNA，可滿足熒光PCR測定需要。

黃煥宜[5]等將鼠抗金黃色葡萄球菌抗體偶聯至Fe3O4納米磁性微球上制備免疫磁性微球，對金黃色葡萄球菌具有較高的捕獲能力，當菌液濃度為103cfu/mL時，捕獲能力可達73%，捕獲能力隨著菌液濃度的增高而下降。王程程等[6]利用鏈霉親和素磁珠和生物素化兔抗金葡菌多克隆抗體制備免疫磁珠，用其分離食品中的金黃色葡萄球菌，捕獲靈敏度可達10cfu/mL，用時小于1h，可用于對食源性金黃色葡萄球菌的快速檢測。

二、免疫磁珠—多重聚合酶鏈式反應（Multiple Polymerase Chain Reaction，MPCR）

周麗珍等[7]利用親和素標記的磁珠和生物素標記的spa單克隆抗體制備免疫磁珠從痰液中富集金黃色葡萄球菌，再聯合多重聚合酶鏈式反應（multiple polymerase chain reaction，MPCR）檢測痰液樣本中MRSA菌株mecA基因和femA基因，進行MRSA菌株的檢測。與常規細菌培養+Vitek-2全自動微生物分析儀相比，在檢出率、敏感性和特異性等方面均有優勢，尤其是可將檢測時間有原來的48～72h，縮短至4～6h。該方法可以對臨床患者痰液樣本中的MRSA進行敏感、特異、快速的檢測，有助于MRSA菌株的診斷與控制。

三、免疫磁珠富集—PCR法

鄧奕等[8]將金黃色葡萄球菌多抗偶聯于500nm超順磁性微球制備免疫磁性微球，聯合PCR方法檢測牛奶中金黃色葡萄球菌進行檢測。建立方法具有較高檢測特異性和靈敏度，不需增菌培養，檢測靈敏度為104cfu/mL。高濤[9]等利用免疫磁珠—實時熒光PCR技術對586份各類食品樣品中的單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌3種致病菌進行檢測，并與傳統培養方法比較，兩種方法符合率為93.22%，而且新方法可在2h～3h內得出檢測結果，大大縮短了檢測時間，是一種可推廣應用于食源性微生物檢測的方法，也可以應用于突發公共衛生事件應急檢測。

馬凱等[10]利用超順磁性納米微球和金黃色葡萄球菌、志賀氏菌多克隆抗體制備免疫磁珠，從豬鮮肉中捕獲兩種病原菌，提取核酸后，使用兩重熒光定量PCR法進行快速核酸檢測，對兩種細菌的檢測限可達2.52cfu/g和1.36cfu/g，是一種可以快速進行食源性金黃色葡萄球菌和志賀菌檢測的方法。

四、免疫磁珠—ATP發光檢測技術

ATP發光檢測技術具有簡便快速和重現性好的特點，但是該技術靈敏度較低，最低檢測限為103個細菌/mL，不符合衛生學檢驗要求。但將該技術與免疫磁珠分離技術相結合，則在微生物檢測、細胞分離等領域有著越來越廣泛的應用。寇曉晶等[11]將免疫磁珠和ATP生物發光技術聯合，建立了一種快速檢測沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌等食品中常見致病菌的新方法，能夠大大降低檢測限，檢測靈敏度可達102cfu/mL。

五、免疫磁珠—重組酶聚合酶擴增技術（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）

重組酶聚合酶擴增是恒溫擴增技術的一種，相較傳統的PCR擴增技術，具有較高的靈敏性，而且能夠在簡便而無須昂貴實驗設備條件下開展應用，能夠在基層開展應用。近年來在食源性病原微生物檢測及醫學診斷領域得到快速發展。王亞磊[12]將制備的金黃色葡萄球菌單克隆抗體與直徑為750nm的羧基磁珠偶聯制備免疫磁珠，用于捕獲樣品中的金黃色葡萄球菌，有較好的捕獲率和特異性，捕獲靈敏度可達102cfu。同時，針對金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因設計RPA引物并進行反應條件的優化后，利用免疫磁珠-RPA-LF技術對金葡菌基因組的最低檢測靈敏度可達600fg。通過對牛奶樣品中金葡菌的檢測顯示，當樣品中金葡菌濃度低至7.5×102cfu/mL時，亦可檢出陽性結果。

六、免疫磁珠—環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是NotomiT等[13]在2000年開發的一種新型的恒溫核酸擴增方法，其特點是選取檢測目的基因6個區域設計4—6條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下進行核酸擴增。與傳統PCR技術比較，無須溫度循環過程，避免了對溫度循環和PCR儀器設備的需求，具有簡單、快速、特異性強的優點。在病原菌檢測、臨床診斷、環境和食源安全檢測領域有廣泛應用前景。

呂觀等[14]將免疫磁珠和環介導等溫擴增技術相結合，將生物素標記的鼠傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌抗體偶聯于鏈酶親和素磁珠上制備免疫磁珠，每毫克磁珠與6?L金黃色葡萄球菌抗體結合，對104cfu/mL金黃色葡萄球的捕獲效率可達56.80%。用建立的免疫磁珠-LAMP方法，針對nuc基因設計檢測引物，對牛肉中金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度可達4.4cfu/mL，可以有效地從牛肉中檢測金黃色葡萄球菌。

許會會[15]將制備的金葡菌多抗包被至二氧化硅磁珠表面制備免疫磁性微球，對牛奶中金葡菌的檢測靈敏度可達2.81×102cfu/mL。結合LAMP方法，檢測金葡菌nuc基因，對采集的牛奶樣品檢測限可達5cfu/mL。

七、免疫磁珠—量子點技術

白冰等[16]將生物素化兔抗金葡菌多抗偶聯于鏈親和素磁珠制備免疫磁性微粒，用其富集金黃色葡萄球菌，再利用量子點熒光標記和微型光纖光譜儀進行菌體檢測。結果表明，對金葡菌最佳富集條件為捕獲時間45min，磁分離1.5min，PBS濃度10mmol/L，可以捕獲103cfu/mL濃度的菌液。整個檢測可以在2h內完成，并且具有較高的特異性。

李倩倩等[17]建立了一種免疫磁珠和量子點相結合檢測金葡菌、志賀菌和沙門菌的方法。先用包被有三種目標菌多抗的免疫微球富集目標菌，再加入用多色CdSe量子點交聯的抗金葡菌、抗志賀菌和沙門菌多抗反應，通過熒光顯微成像法進行檢測。結果顯示，可在2h內對同一反應體系中的3中目標菌進行快速檢測，對樣品中目標菌的檢測表明檢測靈敏度可達103cfu/mL，表明該方法是一種能夠快速、特異靈敏地檢測金黃色葡萄球菌的方法。

八、結論

金黃色葡萄球菌引起的感染和食物中毒是一個世界性的公共衛生問題，基于細菌培養的傳統方法雖然是目前通用的檢測方法，但是需要較長的培養時間，不能進行快速和微量檢測，不利于盡早診斷和治療。而隨著相關生物檢測技術的發展，基于分子生物學、免疫學以及生物傳感器等快速且高靈敏度檢測方法，將是今后開展病原菌檢測的發展方向。

參考文獻

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