痛風(fēng)患者NLRP3基因多態(tài)性觀察

李瑞，苗蕾，陳鄔錦，冀琨，張蓓，孫玉萍

1 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊830011；2 新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；3新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院

痛風(fēng)(Gout)是由于尿酸鹽(monosodium urate，MSU)晶體沉積于關(guān)節(jié)及周圍軟組織引起的以局部紅、腫、熱、痛為主要臨床表現(xiàn)的自限性炎癥性關(guān)節(jié)炎[1]。痛風(fēng)急性發(fā)作時(shí)患者受累關(guān)節(jié)呈刀割樣疼痛，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能受限，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來高嘌呤膳食模式及生活習(xí)慣的不斷改變，導(dǎo)致痛風(fēng)的發(fā)病率呈逐年增高趨勢[2]。目前全球痛風(fēng)發(fā)病率0.1%～10%，而我國痛風(fēng)發(fā)病率約為2%[3]。目前，關(guān)于痛風(fēng)發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究不斷增多，但確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。痛風(fēng)的急性發(fā)作受遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響，而遺傳因素在痛風(fēng)的急性發(fā)作過程中占主要作用。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，三磷酸腺苷結(jié)合家族G2(ABCG2)、蛋白激酶D2 (PKD2)、葡萄糖易化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9(SLC2A9)、鉀電壓門控通道Q亞家族成員1(KCNQ1)、溶質(zhì)載體家族22成員12(SLC22A12)、磷酸鈉運(yùn)輸?shù)鞍?(SLC17A1)和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)等基因的多態(tài)性與痛風(fēng)的易感性間存在相關(guān)性。作為內(nèi)源性危險(xiǎn)信號分子的MSU晶體能有效激活Toll樣受體信號通路和NOD樣受體信號通路，產(chǎn)生并釋放促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1(IL-1)、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，通過級聯(lián)放大效應(yīng)啟動炎癥應(yīng)答，引起痛風(fēng)的急性發(fā)作[6]。2013年1月～2019年6月,我們聚焦尿酸鹽晶體激活NOD樣受體信號通路引起痛風(fēng)急性發(fā)作這一致病機(jī)制，選取NLRP3基因作為目標(biāo)基因，通過分子生物學(xué)方法檢測痛風(fēng)患者目標(biāo)基因多態(tài)性，旨在探索NLRP3基因多態(tài)性與痛風(fēng)易感性的關(guān)系，為探索痛風(fēng)遺傳因素及痛風(fēng)的診斷及治療方法提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院同期收治的痛風(fēng)患者267例及健康者448例，均為男性漢族。痛風(fēng)的診斷符合2015年美國風(fēng)濕病學(xué)會制定的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。納入者年齡20～70歲，且相互間沒有血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除患有惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、肝腎疾病、自身免疫性疾病者，排除近期服用促進(jìn)或降低尿酸排泄藥物者。本研究獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，納入者知情同意。兩組年齡具有可比性，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、收縮壓(DBP)、血尿酸(SUA)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)水平在兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)，且除了HDL-C外，其他指標(biāo)均表現(xiàn)為痛風(fēng)患者高于健康者。

1.2 痛風(fēng)患者及健康者血清NLRP3基因檢測及分型 收集痛風(fēng)患者及健康者禁食12 h晨起空腹靜脈血液5 mL,3 500 r/min分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)在國際人類基因組單體型圖計(jì)劃(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)中顯示的SNP信息，選取NLRP3基因rs7525979、rs3806268 和rs10754558三個多態(tài)性位點(diǎn)為目標(biāo)位點(diǎn)。選用基因組DNA提取試劑盒，按操作說明提取外周靜脈血液標(biāo)本中的基因組DNA，用經(jīng)過Primer 3軟件設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR(polymerase chain reaction)反應(yīng)，最后用探針法對目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。NLRP3基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的連接產(chǎn)物序列如下：rs7525979上游引物為5′-CACTTCCAGTTTTTGCCGGG-3′,下游引物為5′-GGGAATGGCTGGTGCTCAAT-3′；rs3806268上游引物為5′-GCTGTTTGACCCCGATGATGAG-3′,下游引物為5′-CCCCAGGCTCCTCTGTGTCA-3′；rs10754558上游引物為5′-CTTTACGCCAGGGTGAGGAAGAC-3′,下游引物為5′-AGCGGGAATGATGATATGAGCA-3′。

1.3 資料收集方法 選用統(tǒng)一的問卷收集研究對象的一般健康資料，包括姓名、性別、年齡、民族、現(xiàn)病史、既往史、家族遺傳史、服藥史、身高、體質(zhì)量、收縮壓、舒張壓等。選用新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科日立7060全自動生化分析儀測定納入者SUA、TG、TC、BUN、GLU、CREA、HDL-C和LDL-C等一般生化指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 痛風(fēng)患者及健康者NLRP3基因rs7525979、rs3806268及rs10754558位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較 痛風(fēng)患者NLRP3基因rs7525979位點(diǎn)基因型CC、CT、TT分別為177、81、9例，等位基因C、T頻率分別為81.5%(435/534)、18.5%(99/534)；健康者分別為289、146、13例，等位基因頻率分別為80.8%(724/896)、19.2%(172/896)。痛風(fēng)患者NLRP3基因rs3806268位點(diǎn)基因型GG、GA、AA分別為59、118、90例，等位基因G、A頻率分別為44.2%(236/534)、55.8%(298/534)；健康者分別為104、238、106例，等位基因頻率分別為49.8%(446/896)、50.2%(450/896)。痛風(fēng)患者NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)基因型GG、GC、CC分別為48、135、84例，等位基因G、C頻率分別為43.3%(231/534)、56.7%(303/534)；健康者分別為95、234、119例，等位基因頻率分別為47.3%(424/896)、52.7%(472/896)。痛風(fēng)患者及健康者NLRP3基因rs3806268位點(diǎn)基因型和等位基因分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P均<0.05)。

2.2 NLRP3基因rs7525979、rs3806268及rs10754558位點(diǎn)基因型與痛風(fēng)易感性的相關(guān)性 加性模型分析結(jié)果表明，與GG基因型比較，NLRP3基因rs3806268位點(diǎn)AA基因型為痛風(fēng)的保護(hù)因素(OR為0.58,95%CI:0.41～0.84)；隱性模型分析結(jié)果表明，與GG+GA基因型比較，AA基因型為痛風(fēng)的的保護(hù)因素(OR為0.61,95%CI:0.44～0.85)。rs7525979和rs10754558位點(diǎn)在不同遺傳模型中未見與痛風(fēng)存在相關(guān)性(95%CI橫跨1)。

3 討論

痛風(fēng)是目前我國的第二大代謝性疾病，其急性發(fā)作與多因素密切相關(guān)。研究表明，男性痛風(fēng)的發(fā)生率高于女性，但女性隨著年齡的升高，體內(nèi)激素水平的不斷變化，使得女性痛風(fēng)的發(fā)生率也逐漸增高[8]。高嘌呤飲食如攝入過多海產(chǎn)品、動物內(nèi)臟等或飲酒均能增加痛風(fēng)的發(fā)病率[9]。痛風(fēng)具有家族遺傳性的特點(diǎn)且其發(fā)生與肥胖、高血壓、糖尿病、腎臟疾病、心腦血管疾病等密切相關(guān)[10-13]。本研究結(jié)果顯示，BMI、DBP、SUA、GLU、BUN、CREA、TG、HDL-C 和LDL-C水平在痛風(fēng)組和健康對照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

MSU晶體通過被模式識別受體(Pattern-recognition receptors，PRR)識別可啟動機(jī)體先天性免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，而位于細(xì)胞膜上的Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)和位于細(xì)胞質(zhì)中的NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)是機(jī)體內(nèi)兩大類重要的PRR。研究表明，NLR可與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和半胱天冬氨酸酶(caspase-1)一起形成炎性體，參與調(diào)控多種疾病，如痛風(fēng)、糖尿病、腎臟疾病、動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腸炎、口腔疾病等[14-15]。NLRP3(NLR family，pyrin domain containing 3)屬于NOD樣家族成員，可通過其富含亮氨酸重復(fù)序列的羧基端(leucine rich repeat，LRR)識別MSU晶體并與之結(jié)合，通過自身寡聚化，活化相關(guān)受體。此時(shí)位于NLRP3氨基端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(PYD)即可與ASC羧基端的PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，招募ASC。再通過ASC氨基端的CARD結(jié)構(gòu)域與caspase-1前體的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，活化caspase-1。活化的caspase-1能加工并分泌成熟的IL-1β、IL-18等促炎細(xì)胞因子，而成熟的IL-1β能夠通過活化T細(xì)胞從而激活NF-KB或MAPK信號通路，啟動先天性免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，引起痛風(fēng)的急性發(fā)作[16]。

NLRP3基因多態(tài)性與疾病易感性間關(guān)系的研究已經(jīng)開展。LEE等[17]的薈萃分析結(jié)果表明NLRP3基因rs10754558位點(diǎn)基因突變與自身免疫和炎癥性疾病間無相關(guān)性，但WU等[18]的研究結(jié)果則發(fā)現(xiàn)rs3806268位點(diǎn)多態(tài)性與女性非結(jié)核性肺部疾病間存在相關(guān)性；張鯤等[19-20]的研究發(fā)現(xiàn),rs10754558位點(diǎn)突變與下肢動脈硬化閉塞癥遺傳易感性間存在相關(guān)性，且GG基因型為該疾病的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLRP3基因rs3806268位點(diǎn)基因型和等位基因在痛風(fēng)組和對照組間分布具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異,且該位點(diǎn)AA基因型為痛風(fēng)的保護(hù)性因素，能降低痛風(fēng)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。NLRP3炎性信號通路可能參與了痛風(fēng)炎癥的發(fā)病，NLRP3能夠通過活化IL-1β炎性因子，調(diào)控機(jī)體炎性反應(yīng)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，NLRP3基因多態(tài)性與痛風(fēng)易感性研究深入開展將為痛風(fēng)治療藥物的研制及防止痛風(fēng)發(fā)作提供新靶點(diǎn)。

綜上所述，NLRP3基因rs3806268位點(diǎn)基因多態(tài)性與痛風(fēng)易感性間存在相關(guān)性，rs3806268位點(diǎn)突變可能是痛風(fēng)的保護(hù)性因素。但本研究依然存在一些局限性，如本研究為病例對照研究，樣本含量還不十分充足且研究對象來源于同一地方的同一醫(yī)院，可能存在選擇偏倚，結(jié)果不能得以廣泛推廣。因此為更好的探索痛風(fēng)發(fā)病的遺傳因素，今后大樣本、前瞻性研究的開展是必不可少的。