12類68種獸藥殘留同步檢測方法的建立

鹿翠珍 王建娜 溫春曉 王立國 西迎/正大集團（秦皇島正大有限公司）066200

錯綜復雜的全球食品供應鏈既豐富了中國消費者的餐桌文化，也為食品安全的保障工作帶來了新的挑戰。如今，食品安全不再是傳統的單個國家、企業或者行業組織就能解決的問題，而是需要全食品產業鏈乃至更廣泛的社會力量的通力合作與共同治理。隨著畜牧業規模化、商業化的發展，獸藥及飼料添加劑在畜牧業生產中得到了廣泛運用及食品數量和品種的急劇增多，獸藥管控項目增加，限量加嚴，檢測面臨著人員、設備和空間的投入，越來越高昂的檢測費逐漸成為企業監管瓶頸，因此急需要高效的精確的檢測技術做保障。我們的科研方法就是本著這樣的服務理念，采用獸殘同步檢測法，實現多種獸藥殘留快速、準確檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑和材料

標準品：（純度96%，標準物質均為德國Dr公司生產）、金剛烷胺D15（內標）、氘帶磺胺甲惡唑內標、氘帶諾氟沙星內標、內標羅紅霉素：(純度99%，德國)、甲醇（高效液相色譜級Dikma）、甲酸（高效液相色譜級Kermel）、乙腈（高效液相色譜級）、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、實驗用水（超純水）、檸檬酸溶液：0.1mol/L。稱取21.01g檸檬酸，用水溶解，定容至1000mL。磷酸氫二鈉溶液：0.2mol/L。稱取28.41g磷酸氫二鈉，用水溶解，定容至1000mL。Mellvaine緩沖液：將1000mL 0.1mol/L檸檬酸溶液與625mL0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液混合，用氫氧化鈉溶液調節pH=4.0±0.05。Na2EDTA-Mellvaine緩沖液: 0.1mol/L。稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉放入1625mL Mellvaine緩沖液，使其溶解、搖勻。甲醇水溶液（5%）：稱量25mL甲醇與475mL水混合。定溶液：475mL水與25MmL乙腈與1.5mL甲酸混合。Oasis HLB 固相萃取柱（3cc，60mg，美國Waters公司，使用前依次用5mL 甲醇，10mL 水活）。混合標準工作液：使用標準儲備液用甲醇稀釋至適宜濃度。

混合內標工作液：使用內標標準儲備液用甲醇稀釋至適宜濃度。

1.2 儀器

API4500串聯質譜儀、高速冷凍離心機、渦旋混合器、超聲波、氮吹儀 精密分析天平（感量0.00001g）；天平（感量0.01g）、振蕩器、絞肉機、空氣真空泵、尼龍微孔過濾膜：∮ 0.22μm、酸度計。

1.3 分析步驟

1.3.1 試樣的提取和凈化 準確稱取2.00g(精確至0.01g)試樣至 50mL 離心管中，加入20mL 0.1mol/L Na2EDTAMellvaine緩沖液溶液，振蕩15min，8000r/min，離心10min。移取上清液于上述已活化的HLB固相萃取柱中，控制流速為1mL/min，先用5mL水淋洗、再用3mL 5% 甲醇溶液淋洗，流干后真空泵抽干，然后用5mL 甲醇分兩次洗脫。洗脫液在60℃水浴中氮氣吹至近干，加1.0mL定溶液，渦旋30s溶解，用0.2μm濾膜過濾后供液相色譜- 質譜/ 質譜測定。

1.3.2 混合基質校準曲線的制備 稱取5個陰性2.00g（精確至0.01g）試樣至 50mL離心管中，加入適量的混合標準工作液及混合內標工作液，按照1.3.1步驟進行同步提取和凈化。

1.4 色譜條件

色譜柱：Kinete?2.6μm 50×3.0mm。流動相：0.1%甲酸水（A）、乙腈（B）具體見表1。流速：400ul/min。

表1 流動相比例

1.5 質譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI源）、輔助加熱器溫度：500℃、正離子方式掃描/負離子掃描、檢測方式：多反應監測（MRM）；電噴霧電壓：5.5kV。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇和優化

肉類樣品的主要成分是水(高達70%)、蛋白質(15%～25%)、脂肪(5%～25%)和磷脂(1%～3%)。蛋白含量高，選用沉淀蛋白效果佳的物質作為提取劑，本研究分別用乙腈、三氯乙酸、乙酸鉛、Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液，結果發現，在提取過程中，Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液凈化處理效果最佳，試驗過程中用0.1mol/L Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液變性形成沉淀，通過離心后除去。

2.2 提取方式的選擇

分別采用渦旋、超聲波提取、均質提取和振蕩4種提取方式。結果表明，振蕩提取效果最好，而且回收率比較穩定，因此本方法采用振蕩的提取方式。

2.3 凈化方法

動物源性食品中基質復雜，凈化樣品，降低雜質對測定的影響十分重要。凈化過程我們選用獸殘常用前處理柱MCX小柱、HLB小柱、C18。MCX小柱68項滿足回收率要求項目有48項，成功率為70.6%，其中四環素族和大抗球蟲類 無法保留，不采取；C18小柱68項滿足回收率要求項目有45項，成功率為66.2%，其中磺胺類、喹諾酮類及酰胺醇類無法保留，不采取；HLB小柱68項全部滿足回收率要求，因此本方法采用HLB凈化柱。

2.4 流動相梯度選擇

本試驗包括正離子和負離子，流動相的pH值影響正負離子的離子化，采用0.005%甲酸-乙腈水溶液，0.01%甲酸-乙腈水溶液，0.1%甲酸-乙腈水溶液，0.2%甲酸-乙腈水溶液，0.5%甲酸-乙腈水溶液 逐個梯度摸索流動相條件，結果表明，0.1%甲酸-乙腈流動相體系在一定梯度下可以很好地將68種獸殘分離開來，其靈敏度和分辨率都滿足實驗要求。

2.5 樣品基質效應的消除

在應用超高效液相色譜-串聯質譜法測定復雜樣品時，基質對于藥物的響應有很大不同，對不同的藥物具有增強或抑制效應，從而影響定量的準確性。本方法為了消除基質效應對檢測結果的影響，日常定量用標準曲線采用5點及以上陰性樣本添加方式。

2.6 方法的檢出限、回收率、重復性及線性范圍

以陰性雞肉為代表，按照上述處理方法對樣品中68種獸藥進行10、20、50μg/kg等3個濃度水平的添加回收試驗，其平均回收率在82.2%～102.6% 之間，RSD在2.9%～20.9%之間。本試驗采用在空白組織中添加目標組分的方法，依據特征離子色譜峰的3倍信噪比（S/N）計算最低檢出限，結果見表2。

表2

項目 母離子子離子 掃描模式線性范圍相關系數最低檢測限ppb替米考星 869.5 174.0 + 0.5-100 0.998 1 869.5 132.4 +吉他霉素 772.0 109.0 + 0.5-100 0.995 1 772.0 173.7 +泰樂菌素 916.6 174.0 + 0.5-100 0.998 1 916.6 145.4 +克林霉素 425.3 125.8 + 0.5-100 0.998 1 425.3 377.2 +土霉素 461.0 425.9 + 5-100 0.999 10 461.0 443.1 +四環素 445.1 410.0 + 5-100 0.996 10 445.1 154.0 +金霉素 479.1 444.0 + 5-100 0.997 10 479.1 462.3 +強力霉素 445.1 428.1 + 5-100 0.996 10 445.1 410.1 +克球酚 192.1 101.0 + 5-100 0.998 10 192.1 87.2 +卡巴氧 263.2 230.9 + 0.5-100 0.997 1 263.2 90.1 +喹乙醇 264.3 143.1 + 0.5-100 0.998 1 264.3 212.1 +阿奇霉素 749.6 591.7 + 0.5-100 0.998 1 749.6 157.9 +甲硝唑 172.1 127.9 + 0.5-100 0.998 1 172.1 82.1 +羥基甲硝唑 188.1 126.0 + 0.5-100 0.998 1 188.1 123.0 +二甲硝唑 141.9 96.1 + 0.5-100 0.996 1 141.9 81.1 +羥甲基甲硝唑158.1 140.1 + 0.5-100 0.999 1 158.1 112.2 +阿莫西林 366.0 114.2 + 5-100 0.996 10 366.0 208.3 +氨芐西林 350.0 160.2 + 5-100 0.996 10 350.0 191.9 +泰妙菌素 494.1 192.1 + 0.5-100 0.997 1 494.1 119.0 +金剛乙胺 180.2 163.1 + 0.5-100 0.997 1 180.2 121.2 +氯霉素 320.9 152.0 - 0.1-100 0.995 0.1 320.9 257.0 -地塞米松 436.9 361.3 - 0.5-100 0.999 1 436.9 307.4 -甲砜霉素 354.1 184.9 - 0.5-100 0.997 1 354.1 289.8 -氟苯尼考 356.1 335.7 - 0.5-100 0.996 1 356.1 185.2 -磺胺甲噻二唑271.0 156.0 + 5-100 0.996 10 271.0 108.0 +磺胺 唑 268.0 156.0 + 0.5-100 0.997 10 268.0 113.0 +

項目 母離子子離子 掃描模式線性范圍相關系數最低檢測限ppb磺胺醋酰 215.0 156.0 + 5-100 0.997 10 215.0 108.1 +苯甲酰磺胺 277.0 156.0 + 5-100 0.996 10 277.0 108.0 +磺胺苯吡唑 315.0 156.0 + 5-100 0.997 10 315.0 160.0 +磺胺鄰二甲氧嘧啶311.0 156.0 + 5-100 0.998 10 311.0 108.0 +磺胺異 唑 268.1 156.0 + 5-100 0.999 10 268.1 113.0 +甲氧芐啶 291.1 230.1 + 5-100 0.996 10 291.1 261.0 +泰萬菌素 1042.6109.0 + 0.5-100 0.997 1 1042.6814.5 +氟苯尼考胺 248.0 230.0 + 0.5-100 0.997 1 248.0 130.0 +螺旋霉素 843.3 174.2 + 0.5-100 0.999 1 843.3 142.2 +磺胺氯吡嗪 285.2 156.2 + 5-100 0.997 10 285.2 108.3 +喹乙醇代謝物189.2 145.1 + 0.5-100 0.998 1 189.2 143.1 +苯硫胍 447.1 383.0 + 5-100 0.996 10 447.1 415.0 +芬苯噠唑 300.0 267.9 + 5-100 0.995 10 300.0 158.7 +氨丙啉 243.0 150.0 + 5-100 0.997 10 243.0 94.0 +阿苯達唑 266.0 233.9 + 5-100 0.998 10 266.0 190.9 +奧芬達唑 316.0 158.9 + 5-100 0.995 10 316.0 190.9 +阿維拉菌素 249.0 190.3 - 5-100 0.999 10 249.0 205.0 -

3 結論

本方法建立了動物源性食品中68種藥物殘留的超高效液相色譜-串聯質譜法測定方法。該方法簡單、快捷、準確，重現性好，回收率和檢測限GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》附錄F的規定，，適合動物源性食品中12類68種藥物殘留的日常分析。