新疆紅肉蘋果果實性狀及MYB10啟動子基因型鑒定分析

閆 鵬，朱燕飛，梅 闖，馮貝貝，韓立群，艾沙江·買買提，馬 凱，王繼勛

(新疆農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學觀測試驗站，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆野蘋果(Malussieversii(Ledeb)Roem.)，屬薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)落葉小喬木，株高 2～10 m，最高可達 14 m。在世界上主要分布于中亞的哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、烏茲別克斯坦、塔吉克斯坦[1]。在我國主要分布于新疆西部山區(qū)，新疆野蘋果主要分布于新疆伊犁河谷兩側(cè)的天山中，其次分布于塔城地區(qū)的塔爾巴哈臺山南麓和巴爾魯克山西側(cè)等山地。新疆野蘋果是第三紀孑遺物種，被認為是栽培蘋果的祖先[2-4]。我國新疆野蘋果的環(huán)境適應(yīng)能力強，其果實形態(tài)、著色、風味，植株高矮、樹形等變異很多，而且由于自然選擇形成了許多抗旱、抗寒、抗病蟲、耐瘠薄的特異單株[5]。新疆紅肉蘋果是新疆野蘋果的一種，果實和葉子中色素含量高，果皮和果肉在生長過程中和成熟后都保持著紅色[6-8]。同時，新疆野蘋果及其紅肉變型(Malussieversiif.neidzwetzkyana)是世界栽培及紅肉蘋果的祖先種，不僅遺傳多樣性豐富，而且是品質(zhì)育種的基因庫[9-10]。近年來，研究植物葉、花、果的類黃酮代謝途徑，形成其色澤形成的分子基礎(chǔ)，明確花色素苷在植物色澤形成過程中的重要作用。花色素苷的產(chǎn)生與積累使不同的種類和品種乃至組織器官呈現(xiàn)出不同的色彩[6]。研究表明，影響花色素苷生物合成代謝的基因有兩類：一類是不同植物共同具有的結(jié)構(gòu)基因，直接編碼花色苷生物合成酶類[11]；另一類是調(diào)節(jié)基因，調(diào)節(jié)花色苷生物合成結(jié)構(gòu)基因表達的強度和過程及色素在空間和時間上的積累[8]。【前人研究進展】植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，MYB轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥、玉米、蘋果、葡萄等作物的各器官著色的研究表明，MYB類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物花色素苷形成過程的調(diào)控，對植物的色澤發(fā)育都起到重要作用[12]。在蘋果中，已經(jīng)有3個MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因得到克隆[13-15]，分別是MdMYB1(DQ886414)，MdMYB10 (EU518248)和MdMYBA(AB279598)，分別從‘Cripps Pink’， ‘Red Field’和MdMYBA(AB279598) 蘋果中克隆。其中，MdMYBA在蘋果中的表達具有組織、品種和種的特異性，在深紅色的品種中表達量高；紅肉蘋果品種‘Red Field’的MdMYB10 基因的啟動子存在多個結(jié)合MdMYB10 蛋白的重復(fù)序列，重復(fù)序列的個數(shù)決定了MdMYB10 的表達強度，進而影響紅肉蘋果的紅色程度，該基因組成型過量表達，在整個植株水平產(chǎn)生更多的花青苷，最終導致果肉、葉片、枝條等器官均呈現(xiàn)紅色；MdMYB1、MdMYB10和MdMYBA基因的功能也高度相似，表明三者互為等位基因。MdMYB10基因啟動子在紅色果皮品種中存在6個串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu) (R6)，在綠色果皮品種中僅為1個串聯(lián)重復(fù) (R1)，啟動子上的這種結(jié)構(gòu)差異通過MYB10蛋白的自激活作用造成蘋果果皮顏色的差異。MYB10 啟動子上差異是否決定葉片色澤發(fā)育的過程尚不清楚。【本研究切入點】新疆紅肉蘋果可以為紅肉蘋果育種提供良好的基因來源。但是對于新疆紅肉蘋果的紅肉機理研究較少，MYB10是決定紅肉的基因，但是其在新疆紅肉蘋果中啟動子類型缺乏進一步的鑒定和研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】對29個新疆紅肉蘋果的啟動子類型進行PCR鑒定，通過葉片的啟動子類型進而鑒定新疆的紅肉蘋果的紅肉MYB10啟動子類型，分析新疆的紅肉MYB10啟動子類型，及紅肉呈色機理提供更充分的理論依據(jù)，測定紅肉蘋果資源的果實的相關(guān)性狀。

1 材料與方法

1.1 材 料

從新疆采集各個地方的29個紅肉蘋果品種，全部集中保存于阿克蘇蘋果試驗站。2017～2018年在原生地測定果實性狀，2018年5月在選取不同年齡的植株葉片，置于硅膠中干燥保存，用于提取DNA。表1

DNA提取試劑、2×PCR Mix，2 000 Marker、 Gene Green核酸染料購自天根生物公司，其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 供試紅肉蘋果品種及編號Table 1 Varieties and numbers of red fresh apple tested

1.2 方 法

1.2.1 果肉觀測及測定

供試果實各取5個，根據(jù)《蘋果種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[16]對各紅肉蘋果資源進行統(tǒng)計。

1.2.2 葉片全基因組DNA提取

參照天根的植物DNA提取試劑盒提取蘋果葉片的DNA，利用NCBI公布的蘋果同源序列(GeneBank:AFP89357.1) 設(shè)計引物如下：

基因Gene引物PrimerMcMYB10-F1[17]F1:5′-GCATTGCCTCTTCATCTCTCTACTG-3′R1:5′-TTTTCTCACACTCAGGTTTTCGTTATATCCC-3′MYB10-F2[18]F2:5′-TGCCTGGACTCGAGAGGAAGACA-3′R2:5′-CCTGTTTCCCAAAAGCCTGTGAA-3′

1.2.3 啟動子序列鑒定

利用PCR電泳產(chǎn)物條帶大小對29個品種MYB10啟動子參照電泳條帶大小進行初步鑒定分析。參照龐慧[17]和許海峰[18]等的測序結(jié)果，進行初步分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅肉蘋果果肉觀測

依據(jù)《蘋果種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》果肉顏色的描述分為10類，用于紅肉蘋果描述分為淡紅和血紅兩類，28個紅肉蘋果資源的果肉呈色的紅色部分存在于果芯和果皮附近的果肉，紅色的果肉在果實中的分布呈絲狀或片狀，其余部分未出現(xiàn)紅色的果肉顏色基本屬于乳白或黃綠色；果芯的顏色分為淡紅色、紅色和血紅色。另編號為YN-4資源的果肉未出現(xiàn)紅色為乳白色，但在其枝條的韌皮部觀測到了紅色，并結(jié)合此次試驗的啟動子類型鑒定，該資源具備MYB10的R1R6類型的啟動子，遂將該資源確定為紅肉資源。只有紅勛1號的果芯、果肉和果皮全為血紅色，屬于比較有特色的紅肉蘋果資源。表2

表2 供試紅肉蘋果品種果肉描述Table 2 Description of red meat varieties tested

2.2 紅肉蘋果資源的數(shù)量性狀差異

研究表明，不同指標的數(shù)量性狀的變異幅度在11.66%～57.10%，單果重的變異系數(shù)最大為57.10%，最大值是YNX-5的單果重，為124.57 g，和栽培蘋果的單果重相差不大，出現(xiàn)最小值是16.57 g，是紅勛1號。可溶性固形物的變異系數(shù)是11.66%，最大值是17.63%為CB-4，最小值是10.66%為JMS-1。可溶性固形物的指標基本上差異不大。果形指數(shù)的平均值為0.91，果實性狀大部分屬于圓形果，果形指數(shù)上未有低于0.8的，ML-1和JMS-1的果形指數(shù)等于和大于1為長圓形。蘋果資源具有豐富的遺傳多樣性。表3

表3 供試紅肉蘋果資源果實數(shù)量性狀變異Table 3 Variation and diversity of fruit quantitative characters of red meat varieties tested

2.3 DNA質(zhì)量檢測

利用天根的DNA提取試劑盒，對紅肉蘋果的葉片進行DNA提取，經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰，濃度和純度都較高，可用于后續(xù)試驗。圖1

圖1 部分DNA電泳圖 Fig.1 Partial of DNA electrophoresis

2.4 MYB10啟動子類型鑒定

研究表明，所有的樣品都為擴增出了2條帶，2條條帶的大小一致，都在250～500 bp，根據(jù)紅肉蘋果中的MYB10基因啟動子類型的試驗及研究結(jié)果，若為單一的180 bp(300 bp)條帶，則為R1型的啟動子；若為單一的300 bp(400 bp)的條帶，則為R6型啟動子。2個條帶都有則為 R6R1型啟動子。研究中使用的引物1在所用的樣品中均擴增出2條條帶，大小在250～500 bp，符合R6R1型啟動子的判斷。圖2

注：M:2 000 Marker (2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)，1～29:紅肉蘋果Note: M:2，000 Marker (2，000 bp，1，000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)，1-29:red fresh apple圖2 MYB10-F1R1 29個紅肉蘋果葉片MYB10啟動子基因型鑒定Fig. 2 MYB10-F1R1 Genotype of MYB10 promoter leaves of 29 red fresh apple strains

研究表明，引物2在29個紅肉蘋果品種(單株)中的擴增結(jié)果顯示全部均為2條帶，所有單株的條帶大小一致，都在500～750 bp。依據(jù)的MYB10啟動子類型的推測。若為單一的750 bp左右大小的條帶則為R6型啟動子，若為500 bp左右大小的條帶則為R1型啟動子。若為2條帶，則為R6R1型啟動子。研究中使用的引物2在所有的樣品中均擴增出2條條帶，大小在500～750 bp，符合R6R1型啟動子的判斷。圖3

注：M:2 000 Marker (2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)，1～29:紅肉蘋果Note: M:2，000 Marker (2，000 bp，1 000，bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)， 1-29: red fresh apple圖3 MYB10-F2R229個紅肉蘋果葉片MYB10啟動子基因型鑒定Fig. 3 MYB10-F2R2 Genotype of MYB10 promoter leaves of 29 red fresh apple strains

3 討 論

Espley等提出在紅色蘋果中MYB10的啟動子有R1和R62個類型，而且由于R6啟動子高度串聯(lián)重復(fù)極大增加了蘋果中的紅色，而R1啟動子多存在于白肉蘋果中，對紅色的產(chǎn)生沒有影響[14，19]。不同研究者使用不同的引物鑒定了MYB10啟動子條帶的大小也不一致[17-20]，但均依據(jù)條帶是否是單一和位置，判定的啟動子的類型。結(jié)合此次研究使用的的2種引物，引物1的2條條帶的大小在250～500 bp，所用樣品均無單一條帶，符合R6R1型啟動子的判斷。引物2在所有的樣品中均擴增出2條條帶，大小在500～750 bp，且所有樣品無單一條帶出現(xiàn)，符合R6R1型啟動子的判斷。

通過自行設(shè)計的引物和前人的研究結(jié)果相比對，利用2對不同的引物對29個紅肉蘋果品種(單株)進行雙重驗證，雖然PCR產(chǎn)物序列沒有測序，但結(jié)果相對可靠。

利用MYB10-F1R1得到的結(jié)果條帶大小在260～480 bp，全部為2條帶，這與前人研究的蘋果MYB10啟動子結(jié)果相吻合，和龐慧等[17]的觀賞海棠的鑒定結(jié)果條帶大小不一致，變色葉類各個品種中分別含有片段大小約300、180 bp 2個類型片段，即R6型和R1型啟動子；常色綠葉類品種中只含有片段大小約180 bp類型的啟動子，即R1型啟動子。而試驗的結(jié)果，所用引物相同，所得條帶大小要大于海棠的MYB10啟動子，說明不同品種中的MYB10啟動子大小可能存在不一致，有差異。

紅肉蘋果作為一個特殊的資源類型，成為了近幾年蘋果領(lǐng)域中的研究熱點。在新疆發(fā)現(xiàn)的紅肉野生蘋果在果實的性狀上，果實大小的多樣性較為豐富，研究中發(fā)現(xiàn)29個紅肉野生蘋果的變異幅度達到了57.10%，單果重由124.57 g到16.57 g，差異之大與筆者在先前研究野蘋果果實性狀的的數(shù)據(jù)大有不同[21]；推測紅肉蘋果可能由人為選擇的因素，而人為選擇的干預(yù)的結(jié)果直接的體現(xiàn)就是果實大小，導致了在果實大小上多樣性較為豐富。此次測定的其他性狀類型均具備一定的多樣性，但不如單果重表現(xiàn)的差異明顯，結(jié)合前人研究的結(jié)果，以及此次的收集的資源具備豐富的遺傳多樣性，不同資源的具體的特性性狀有待于后期進一步觀察驗證。

新疆紅肉蘋果資源類型，在果肉顏色上，紅色多為淡紅色分布于果皮下、果芯附近的果肉中，在果肉中的呈色也多為絲狀和塊狀分布，未呈色的果肉多為黃綠色和乳白色；其中紅勛一號為果肉全紅型。YN-3果肉乳白色未有紅色呈現(xiàn)，但啟動子鑒定其具備R6R1型啟動子。

4 結(jié) 論

利用2對引物對新疆的29份紅肉蘋果的啟動子進行PCR鑒定，經(jīng)過PCR檢測，第1對引物的條帶大小在250 bp和500 bp，而第2對引物檢測條帶大小在500 bp到750 bp。2種引物鑒定結(jié)果一致，全部為R6R1型啟動子。果實在果肉顏色和果實的性狀上具有豐富的多樣性，特別是在果實大小上變異較大，其余性狀指標變異幅度不大。