扁桃AcDHN1基因的克隆及原核表達分析

王 敏，李 疆，李 鵬，田 嘉，羅淑萍

(1.新疆農業科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農業大學，烏魯木齊 830052；3中國農業科學院果樹研究所，遼寧興城 125100)

0 引 言

【研究意義】扁桃(AmygdaluscommunisL.)屬于薔薇科李亞科桃屬扁桃亞屬，又被稱巴旦杏，是世界四大干果之一，我國扁桃的栽培分布區主要位于新疆喀什地區的英吉沙縣和莎車縣及和田地區[1]。扁桃為多年生果樹，一旦花期受到低溫凍害時，會嚴重導致花蕾受凍，坐果率降低，經濟受到重大損失[2]。尤其是新疆周期性的凍害天氣，對扁桃的栽培產生了極大的影響。長期以來，一般都是通過優化栽培環境措施、改善栽培條件來提升扁桃的抗寒性，但是品種抗寒的遺傳特性才是起決定作用的因素。通過扁桃對自身凍害的抗性機制研究，有目的性的發掘利用與其抗性相關的基因，對提高栽培扁桃的抗逆能力，促進產業的健康發展具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】脫水素(Dehydrin)在植物中是一類胚胎發育后期豐富蛋白(late embryogenesis abundant protein, LEA蛋白)，屬于LEA D-Ⅱ家族,分子量大小從9到200 kD不等[3]，脫水素蛋白顯著的特征是在C端或其附近含有至少一個富含賴氨酸的基序，約15個氨基酸殘基(EKKGIMDKIKEKLPG)組成的K片段，K片段可以形成雙親性α-螺旋的二級結構，而α-螺旋則具有親水性和疏水性的雙重特征，是脫水素的重要功能結構，此片段在不同物種間極為保守。N端含有保守基序T/VDEYGNP組成的Y片段，與植物和細菌分子伴侶的核酸結合位點具有同源性。K片段與Y片段之間有可以被磷酸化的約6個絲氨酸串聯構成的S片段。所有的脫水素不一定都含有Y和S片段，但必定都含有K片段，它是第2組LEA區分于其它組的顯著特征[4-5]。脫水素的功能主要表現在植物受到環境脅迫導致細胞失水時能保持細胞內膜系統的結構穩定性，吸附多余的細胞內部游離離子，降低游離離子對植物細胞的傷害；在植物水分缺失時，與其他功能性蛋白相結合，在逆境條件下保障其他蛋白質的結構和功能不異常，保證了植物逆境條件下正常的生理代謝功能維持[6-7]。低溫環境會致使膜脂的形態發生變化，膜透性增大后細胞內的可溶性物質滲漏，引起細胞死亡，是非常重要的非生物逆境之一。近幾年，研究證明在低溫脅迫下，植物脫水素基因的表達對植物抗寒性起正向作用。過量表達脫水素基因能增加擬南芥[8]的低溫抗性，提高抗寒力；小麥[9-10]脫水素WCS120的積累量與冰凍抗性成正相關，可以區分不同冬小麥品種的冰凍抗性強弱；兩種杜鵑[11]雜交后代的葉片中脫水素基因的表達與抗凍性能密切相關；香玲核桃[12]在低溫誘導下，DHN快速大量表達且參與信號轉導中早期基因調控；茄屬[13]在低溫處理下脫水素蛋白合成量增加；馬鈴薯[14]DHN24基因轉黃瓜后可以顯著提高抗低溫脅迫能力；菠菜[15]中脫水素CAP85有明顯的抗凍能力。【本研究切入點】但關于扁桃DHN基因與抗性相關內容尚未見報道。在經濟林業研究中，克隆和分析某一功能基因可從分子水平上了解其結構，可為直接利用該功能基因打下基礎[16-18]。【擬解決的關鍵問題】試驗克隆扁桃AcDHN1基因并對其生物信息學進行分析，構建原核表達載體后在大腸桿菌進行表達，為進一步研究扁桃AcDHN1基因的分子生物學機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

將一年生栽培扁桃'紙皮'的休眠枝進行水培，等其長出3 cm長嫩葉后，置于4℃溫度下脅迫處理24 h，將嫩葉收集在液氮中處理。

大腸桿菌DH5α、pET-32a(+)質粒由實驗室保存，E.coliDH5α感受態細胞實驗室制備?？寺≥d體pMD19-TVector、Pyrobest DNA Polymerasec、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶及BamHI、XhoI限制性內切酶購自TaKaRa公司。Rosetta(DE3)感受態細胞購自全式金生物公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、RNA提取試劑盒RNA plant plus reagentA、DNA Marker D15000+2000購自天根生化科技有限公司。DNA Marker D2000購于生工生物公司。引物由生工生物工程(上海)公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆

扁桃基因組RNA的提取使用天根總RNA提取試劑盒RNA plant plus reagentA。cDNA第一條鏈合成使用Thermo試劑盒。

根據GenBank公布的全長DHN序列設計特異性引物AcDHN-F: 5'- ATGGCGCATT TTGGTTCAACACC-3'； AcDHN-R: 5'- TTAAGCTCCAGTTGTTGGGTG-3'，以扁桃cDNA為模板，PCR擴增扁桃的AcDHN1基因。反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，模板cDNA 1 μL，dNTP MIX10 mmol/L、引物AcDHN-F/R(10 μmol/L)各0.5 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.2 μL，加ddH2O補足到25 μL。反應程序：94℃ 5 min預變性；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s反應35個循環；72℃延伸10 min。

使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，并將其連接到pMD 19-T載體上并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，將篩選后的陽性克隆進行測序。

1.2.2 生物信息學

將獲得的扁桃AcDHN1基因在NCBI上用BLAST比對；使用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)尋找最長的開放閱讀框；利用BioEdit軟件對氨基酸序列進行同源性分析比對；利用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)分析編碼蛋白的氨基酸序列的組成、相對分子質量大小、等電點等理化性質；使用BaCelLo在線軟件(http://gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)對扁桃AcDHN1氨基酸進行亞細胞定位分析；使用Protscale軟件對AcDHN1的氨基酸序列的親水性/疏水性預測；利用MEGA5.0軟件對不同植物之間的DHN蛋白做系統發育分析。

1.2.3 原核表達載體pET-AcDHN1的構建及原核表達

根據AcDHN1編碼框和原核表達載體pET-32a(+)多克隆酶切位點設計引物DHNyF: CGCGGATCCATGGCGCATTTTGGTTCAACACC;DHNyR:CCGCTCGAGTTAAGCTCCAGTTGTTGGGTG。在上下游引物的5'末端分別添加BamH I、Xho I酶切位點及對應的保護堿基。以克隆好的AcDHN1甘油菌提質粒為模板，構建重組載體，用BamHI、XhoI限制性內切酶分別雙酶切重組質粒DNA和pET-32a(+)原核表達載體。分別回收目的片段，T4DNA連接酶，連接后轉化E.coliDH5α感受態細胞，使用氨芐青霉素(Amp)抗性平板篩選重組質粒，通過PCR及雙酶切檢測驗證。重組表達載體命名為pET-AcDHN1。

1.2.4 融合蛋白在大腸桿菌中的誘導表達

將重組表達質粒pET- AcDHN1轉化Rosetta(DE3)感受態細胞，將培養好的重組質粒菌液培養至OD600≈0.6，分別在不同誘導時間與不同IPTG濃度下進行誘導表達。不同誘導時間：取1.0 mL菌液于離心管中，IPTG使用濃度為0.1 mmol/L，對照pET-32a(+)空表達載體轉化菌誘導0和3 h，重組蛋白分別確定0、1、2、3、4、5、6 h誘導時間，溫度28℃。不同IPTG濃度：取1 mL菌液于離心管中，pET-32a(+)空表達載體轉化菌加入IPTG濃度為0、0.2 mmol/L作對照，重組蛋白分別確定0、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mmol/L 6個不同IPTG濃度，溫度28℃，誘導時間3 h。收集菌體后分別加50 μL dd H2O和50 μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液用來裂解菌體，100℃條件下煮沸20 min，冷卻后取8 μL樣品上樣，進行SDS-PAGE(5%濃縮膠和12%分離膠)電泳分析，最終凝膠使用考馬斯亮藍R-250染色并使用脫色液脫色至背景清晰。

2 結果與分析

2.1 基因的克隆與序列

擴增后獲得了924 bp左右的片段。測序結果顯示該基因完整的開放閱讀框長度為924 bp，起始密碼子ATG，終止密碼子為TAA，編碼308個氨基酸。圖1

M：DL2000 Marker；1～4：PCR產物 ；5：陰性對照M：DL2000 Marker；1-4：PCR product ；5：Negative control圖1 基因AcDHN1 PCR擴增Fig.1 PCR results of AcDHN1

2.2 生物信息學

2.2.1 氨基酸序列同源性

利用DNAMAN軟件對氨基酸序列進行分析，顯示AcDHN1氨基酸序列具有2類保守的特征區域，K和Y片段，屬于LEA蛋白的第二家族。對扁桃AcDHN1基因的氨基酸序列進行Blastp比對及ClustalW多重比對，并將扁桃AcDHN1氨基酸序列與其他物種的DHN氨基酸進行多序列對比分析。扁桃AcDHN1氨基酸序列與其他作物DHN氨基酸序列C末端都含有K片段，但K片段含量在不同作物之間不完全一致，而且有些作物在N末端的沒有Y片段。圖2，圖3

2.2.2 扁桃AcDHN1蛋白其他生物信息學功能

通過protparam tool軟件預測扁桃AcDHN1基因編碼蛋白質的相對分子質量為32.377 kD，理論等電點為5.92，分子式為C1387H2109N413O482S3，半衰期為30 h。該蛋白為穩定的親水性蛋白。通過BaCelLo在線進行亞細胞定位分析，扁桃AcDHN1氨基酸定位在細胞核中。

?部分為Y片段，橫線部分為K片段?This is Y segment；The horizontal line is K segment圖2 扁桃AcDHN1基因編碼序列和推導的氨基酸序列Fig.2 CDS and deduced amino acid sequence of AcDHN1

扁桃(Amygdalus communis)AcDHN1(KT949395)；豌豆(Pisum sativum)：PsDHN1(P28639.1)；豌豆(Pisum sativum)；PsDHN2(P28640.1)；白梨(Pyrus bretschneideri)：Pb DHN(XM_009347773.1) ；碧桃(Prunus persica)：PpDHN(XM_007204276.1)；胡蘿卜(Daucus carota)：DaDHN(AB105039.1)； 白梨(Pyrus bretschneideri)：PbCS120(XM_009347771.1) 梅(Prunus mume)：PmDHN3(XM_008243512.1)；枇杷(Eriobotrya japonica)：EjDHN4(KF277188.1)；蘋果(Malus x domestica)：MdDHN4(JQ649459.1)；薺菜(Capsella rubella)：CrDHN(XM006281109.1)；越橘(Vaccinium corymbosum)：VcDHN(KF192819.1)Amygdalus communis：AcDHN1(KT949395)；Pisum sativum：PsDHN1(P28639.1)；Pisum sativum；PsDHN2(P28640.1)；Pyrus bretschneideri：Pb DHN(XM_009347773.1) ；Prunus persica：PpDHN(XM_007204276.1)；Daucus carota：DaDHN(AB105039.1)； Pyrus bretschneideri：PbCS120(XM_009347771.1)； Prunus mume：PmDHN3(XM_008243512.1)；Eriobotrya japonica：EjDHN4(KF277188.1)；Malus x domestica：MdDHN4(JQ649459.1)；Capsella rubella：CrDHN(XM006281109.1)；Vaccinium corymbosum：VcDHN(KF192819.1)圖3 不同植物DHN氨基酸序列同源比對Fig.3 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of DHN from different plants

2.2.3 扁桃AcDHN1蛋白的系統發育

研究表明，其與巴旦杏DHN氨基酸序列同源性為86.72%，碧桃60.18%，蘋果55%，白梨32.79%，枇杷22%，梅26%，證明不同脫水素基因的序列之間存在較大差異，可能是不同物種的脫水素存在結構上的差異性(YSK種片段的不同組合)。圖4

圖4 不同植物DHN氨基酸序列系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the deduced amino sequences of plants DHN protein

2.3 原核表達載體的構建及重組子的鑒定

使用DHNy-F/R引物對重組質粒pET-AcDHN1進行PCR檢測，可擴增得到920左右的目的片段，使用BamHI和XhoI雙酶切重組質粒pET-AcDHN1，可切出920 bp左右片段，pET-AcDHN1重組質粒構建正確。圖5

M：DL15000 Marker；1～4 pET-AcDHN1雙酶切產物；5～7：PCR產物M：DL15000 Marker；1-4 pET- -AcDHN1 double enzyme product；5-7：PCR product圖5 重組質粒pET-AcDHN1的PCR及雙酶切驗證Fig.5 Restriction enzyme digestion and PCR analysis of pET-AcDHN1 recombinant plasmid

2.4 SDS-PAGE電泳

研究表明，重組質粒pET-AcDHN1轉入Rosetta(DE3)在IPTG誘導下，預期的53 KD蛋白分子量附近有一條顯著的蛋白條帶，在一樣的誘導條件下空載體對照并未出現此條蛋白帶。在大腸桿菌中重組質粒pET-AcDHN1誘導并成功表達出了AcDHN1蛋白。SDS-PAGE電泳結果顯示，不同濃度IPTG的誘導時，隨著濃度的增高蛋白量的表達逐步的增加，濃度到0.1 mmol/L后總蛋白表達量增幅不顯著(圖6A)；7個不同時間的誘導條件下，蛋白量的表達先穩步增加后基本不變，推測誘導時間為3 h達到最高表達量(圖6B)。不同誘導時間及不同濃度的誘導劑對重組蛋白的表達都會有一定的影響。通過對誘導條件優化，重組蛋白pET-AcDHN在誘導時間為3 h及IPTG濃度為0.1 mmol/L，出現最佳表達量。圖6

M：蛋白Marker；泳道1，2為pET-32a(+)空載體IPTG 終濃度為0，0.2 mmol/L時誘導3 h；泳道3～8為pET-AcDHN1 IPTG 終濃度分別為0，0.02，0.05，0.1，0.15，0.2 mmol/L時誘導3 h

M reprsents protein molecular weight marker, line 1 and 2 were pET-32a(+) induced with 0.1 mmol/L IPTG for 3 h; line 3-8 were pET-AcDHN1 induced with 0 mmol/L, 0.02 mmol/L, 0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L, 0.15 mmol/L, 0.2 mmol/L IPTG for 3 h

M：蛋白Marker；IPTG 終濃度為0.1 mmol/L時，泳道1，2分別為pET-32a(+)空載體誘導0 h，3 h；泳道3～9分別為pET-AcDHN1誘導0，1，2，3，4，5，6 h；M reprsents protein molecular weight marker, line 1 and 2 were pET-32a(+) induced with 0.1 mmol/L IPTG for 0 h and 3 h, line 3-9 were pET-AcDHN1 induced with 0.1 mmol/L IPTG for 0 h, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, and 6 h圖6 融合蛋白pET- AcDHN1在大腸桿菌中的SDS-PAGE誘導表達Fig.6 SDS-PAGE analysis of the expression of recombined pET- AcDHN 1 in E.coli

3 討 論

脫水素基因是典型的逆境誘導型基因，在植物遭受逆境脅迫時產生廣泛的生物學功能[5]。根據Close 等[5]的分類依據，脫水素初步分為5類，即YnSK2、Kn、KnS、SYn和Y2Kn，其中Y2Kn型則是含有二個Y片段及一到二個K片段，是一類典型的酸性的脫水素基因；Y2Kn及KnS兩個類型優先易受低溫誘導。例如豇豆[19]Y2Kn型的DHNI，它與種子形成過程中的抗凍相關；桃樹[20]PpDHN1編碼一個Y2K2型脫水素蛋白，在低溫誘導時表達量增加；低溫鍛煉后，大麥[21]Dhn5 (Kn型) 大麥DHN8 (SKn型)的積累量與其抵御凍害能力成正相關。試驗從扁桃中克隆得到脫水素基因AcDHN1，屬于典型的Y2Kn型脫水素，受低溫誘導調控。

脫水素是與一類與植物抗逆有關的功能蛋白，若想清楚此蛋白在冷調節途徑中是如何發揮功能左右，則需要從蛋白水平上進行進一步的探究，而原核表達體系是一項完善且成熟的研究蛋白質功能和結構的基礎操作[22]。研究利用新疆栽培扁桃中克隆獲得AcDHN1 基因成功構建到原核表達載體pET-32a(+)中，并在大腸桿菌(ED3)中表達了得到的蛋白質分子質量為53 KD。前期通過軟件預測AcDHN1蛋白分子量為32.38 kD，而在原核表達載體pET-32a(+)中TrxoTag、HisoTag和SoTag等融合標簽蛋白為20.40 KD[23,24]，所以52.78 KD的融合蛋白大小與53KD電泳結果無明顯出入。通過對重組蛋白的誘導條件優化，最終得到在誘導時間為3 h和0.1 mmol/L的IPTG濃度條件下AcDHN1重組蛋白其表達量最適。

SDS-PAGE檢測得到，pET-32a(+)空載體表達量非常小，誘導時間增加時重組蛋白的表達量不斷增高，至3 h之后表達量增高不顯著。說明工程菌的表達效率并不是隨著誘導時間增加表達量逐步升高，確是在3 h表達活性達到最強。推測原因伴隨時間的持續，培養基中的營養物質逐漸減少，不能提供細菌的持續需求[25,26]。為了使重組蛋白高效表達，最終確定最佳的誘導時間3 h，選用最優的0.1 mmol/L IPTG進行誘導表達，IPTG濃度低條件下對誘導效果影響不大，但超高的IPTG濃度條件下致使工程菌受到毒害作用進而生長受到抑制。

4 結 論

研究克隆得到了一個脫水素基因，命名為AcDHN1，該基因全長924 bp、編碼308個氨基酸的多肽，為穩定的親水性蛋白，屬于Y2Kn型酸性脫水素。通過生物信息學分析推測蛋白分子質量為32.4kD，亞細胞定位于細胞核中。同源分析結果顯示，其與巴旦杏親緣關系近DHN氨基酸序列同源性達到86.72%。構建了pET-AcDHN1重組質粒，然后將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達，在大腸桿菌中成功表達了與預期長度一致大小約為52.7 kD蛋白分子量的融合蛋白。對重組蛋白的誘導條件進行優化后，確定該基因在IPTG濃度0.1 mmol/L、誘導3 h表達量最佳。