ISL-1生物學特性及其在竇房結發育、生物起搏中作用的研究進展

范致星，黃從新

1武漢大學人民醫院，武漢 430060;2武漢大學心血管病研究所;3心血管病湖北省重點實驗室

竇房結(SAN)作為心臟的生理起搏點，可參與調控不同生理狀態下的心臟節律。隨著人口老齡化，竇房結退行性變的發生率逐漸上升，其功能改變所引起的頭暈、黑朦、乏力、甚至猝死，被稱為病態竇房結綜合征(SSS)[1]。心臟電子起搏器在世界范圍內已經得到了廣泛的使用，可明顯改善SSS患者的生活質量。然而，電子起搏器仍有較多的缺陷和局限，如需永久性植入導管、電池壽命較短、不受神經體液因素調控等[2]。于是構建一種“生物起搏器”顯得至關重要。生物起搏是指運用各種方法(如基因工程)構建一個與竇房結功能類似的起搏點，在機體正常起搏系統出現異常時發揮替代作用[3]。近年來，生物起搏器構建相關研究多集中在誘導干細胞的定向分化或調控下游的離子通道，雖然取得一定的效果，但仍存在許多不足[4]。轉錄因子胰島素基因增強子結合蛋白1(ISL-1)是SAN發育的關鍵調控因子，其在SAN的形成和發育中起著重要的作用，過表達ISL-1有助于起搏樣細胞的形成[5]。現就ISL-1的生物學特性及其在竇房結發育、生物起搏中的作用研究進展情況綜述如下。

1 ISL-1的生物學特性

ISL-1于1990年由Karlsson教授等[6]首次報道。人類ISL-1基因全長約11 kb，定位在5號染色體的長臂，含6個外顯子。ISL-1蛋白屬于LIM同源框蛋白家族，總共含349個氨基酸。ISL-1轉錄因子由三個結構域構成，包括一個同源結構域和兩個相互串聯的LIM結構域。LIM結構域高度保守，主要含有組氨酸及半胱氨酸，這種結構域可通過形成鋅指結構而介導蛋白與蛋白間的作用[7]。ISL-1的同源結構域為螺旋結構，該種結構有利于其與靶基因的ATTA或TAAT元件偶聯，從而介導蛋白與基因間的作用[6,7]。

目前已有研究證實，ISL-1可作為第二生心區(SHF)心臟前體細胞的分子標志[8]。Pandur等[9]發現，ISL-1基因敲除小鼠在鼠胚第9.5天停止心臟發育或心臟出現嚴重畸形，不能成袢；進一步采用原位雜交法發現，ISL-1基因敲除小鼠左室雖然不受影響，但表現為單個心房或心室，同時伴右室及流出道缺如。Mommersteeg等[10]通過譜系示蹤分析法研究ISL-1在小鼠胚胎發育第7.25～10天時的表達情況，發現ISL-1在新月形生心區的腹側和背側處表達較高，當線性心管形成后，臟壁中胚層和前腸內胚層中逐漸出現ISL-1陽性細胞，在小鼠胚胎發育到第10天時，依然能在臟壁及腹側中胚層檢測到ISL-1，然而在心肌成熟后卻不能檢測到ISL-1的表達。進一步研究顯示，在小鼠胚胎發育到第8.5天時，ISL-1陽性前體細胞遷移到心臟，在右室流出道及右心房、右心室表達，但在其他部位未檢測到；隨著心臟逐漸發育，右房ISL-1表達明顯升高，最后僅局限于右房的起搏區域；在胚胎發育到第14.5天時，ISL-1在心臟神經節區域、SAN和房室結(AVN)區域、房間隔、部分流出道、右室、主動脈、肺動脈、靜脈瓣等部位持續表達；在小鼠出生后第3天，ISL-1仍可在主動脈/肺動脈基部、竇房結及房室結區域表達，但ISL-1表達區域明顯縮小[10]。ISL-1持續在SAN及AVN區域表達提示起搏細胞有可能來源于SHF。同時研究還發現，ISL-1與起搏細胞標志超極化激活環核苷酸門控通道4(HCN4)在部分區域可同時表達，這說明ISL-1與HCN4的表達可能密切相關[10]。另一研究中研究人員將ISL-1與不同細胞系的細胞表面分子標志物進行共染色，發現SAN及AVN區域有一群ISL-1陽性前體細胞并無特定細胞系相關的分子標志物，且隨著胚胎發育，其細胞數量明顯減少[11]。這提示ISL-1陽性前體細胞具備分化為其他不同細胞系的潛能。Weinberger等[12]發現，人類胚胎期的ISL-1也高表達于右房及流出道等SHF結構區，這與小鼠相似，還發現ISL-1也可表達于正常成年小鼠心臟中，但主要在上腔靜脈與右房交匯處、肺靜脈及房間隔周圍、大血管壁內。更有趣的是，上腔靜脈與右房交匯處的ISL-1陽性前體細胞高表達HCN4，這說明ISL-1同樣是成熟SAN的標志。

2 ISL-1在SAN發育中的作用

SAN是一個高度專業化的結構，位于上腔靜脈與右心房交界處的界溝上1/3的心外膜深面[13]。SAN起搏細胞通過細胞膜上的多種離子電流(膜時鐘)和細胞內的鈣循環(鈣時鐘)相互影響導致起搏活動的產生[14～16]。調控SAN發育的分子信號網絡十分復雜，涉及多種轉錄因子的多重調控和相互作用，不同的轉錄因子在SAN及周圍心房工作心肌中呈現出特定的表達模式，在細胞的特異性和分化過程中起著關鍵的作用[17,18]。近年相關研究證實，ISL-1可作為SAN起搏細胞的標志，參與SAN的發育及功能調控。Tessadori等[19]首先證實了ISL-1可調控斑馬魚SAN的發育及功能。Vedantham等[20]同樣證實，ISL-1作為與發育相關的重要轉錄因子，可從上游調控多種轉錄因子及離子通道的表達而參與小鼠SAN的發育。后續的研究進一步證實，ISL-1在哺乳動物SAN胚胎期發育過程中也發揮了至關重要的作用，ISL-1可作為SAN起搏細胞的標志[20]。研究者采用激光捕獲顯微切割技術分離純化得到了小鼠SAN中的起搏細胞并完成測序，發現基因敲除ISL-1后，在SAN中表達豐富的T-box轉錄因子家族3(Tbx3)、HCN4等基因的表達明顯降低，而右房心肌表達豐富相關的基因出現了顯著的上調[20]。這提示ISL-1作為轉錄因子，參與對SAN相關基因的直接調控。Liang等[5]通過ISL-1基因敲除小鼠實驗，證實了ISL-1作為轉錄因子，參與了SAN的胚胎發育，對SAN起搏細胞的存活及功能至關重要。染色質免疫沉淀反應證實，L型鈣通道、ANK2及Tbx3等多種竇房結起搏功能必需的基因中存在ISL-1的結合位點，受到ISL-1調控的SAN特異表達的基因達到40%[5]。SAN是哺乳動物自發電活動的結構基礎，ISL-1是SAN起搏細胞的標志，對其發育和功能起到重要作用。因此，在生物起搏領域，轉錄因子ISL-1受到越來越多的重視，成為研究熱點。

3 ISL-1在生物起搏中的作用

生物起搏是運用分子生物學及其相關技術，對受損的自律性節律點或特殊傳導系統的組織進行修復和替代，使心臟的傳導或起搏功能得以恢復。因此，獲得有效的起搏樣細胞是最終實現生物起搏的前提。近年研究證實，ISL-1陽性前體細胞可能具有多向分化潛能，過表達ISL-1有助于起搏樣細胞的形成。Laugwitz等[21]發現，將ISL-1陽性前體細胞與心臟間充質細胞共培養一段時間后，ISL-1陽性細胞不僅可以維持未分化狀態而且能實現自我更新；將ISL-1陽性細胞與已經分化成熟的心肌細胞共培養，這些ISL-1陽性細胞能夠分化為心肌樣細胞。Moretti等[22]及Bu等[23]同樣發現，在不同的誘導條件下，ISL-1陽性細胞可分化形成不同的心臟細胞系。隨后，Fonoudi等[24]在胚胎干細胞中過表達ISL-1，證實過表達ISL-1可促進人胚胎干細胞向心肌樣細胞分化。這些研究均提示ISL-1可作為將特定類型細胞轉化為心肌樣細胞或者起搏樣細胞的有效轉錄因子，可能是研發緩慢性心律失常生物起搏器的關鍵靶點。Zhang等[25]通過基因轉染方式在脂肪干細胞(ADSCs)中過表達ISL-1，結果發現ISL-1在ADSCs中高表達后，HCN4、Cx45 和 Tbx3等竇房結特異性基因在ADSCs中的表達明顯上調，而Nkx2.5等工作心肌特異性基因表達顯著下調，且可記錄到超極化激活的起搏電流(If)。這項研究結果表明經ISL-1基因修飾的ADSCs產生了一定的高表達竇房結標志性基因并具有細胞內典型超極化電活動的起搏樣細胞。與此同時，Zhang等[26]通過基因轉染的方式將ISL-1和Tbx18兩者一并整合至乳鼠心室肌細胞(NRVM)的基因組中，結果發現ISL-1組、Tbx18組和ISL-1+Tbx18組NRVM搏動頻率均有明顯提升，各組均可檢測到HCN4的表達，但ISL-1+Tbx18組HCN4表達水平最高，搏動頻率提升最為明顯，且ISL-1+Tbx18聯合表達的大多數NRVM能記錄到If電流。此項實驗表明，ISL-1+Tbx18共表達能更明顯的提高HCN4的表達水平，促進NRVM向竇房結細胞轉化，實現起搏樣細胞的重編程。綜合上述兩項最新研究結果我們可以看到，轉錄因子ISL-1能在特定條件下，將脂肪干細胞或已經成熟的心肌細胞誘導為起搏樣細胞。但一種轉錄因子作用往往有限，同時聯合多種轉錄因子可能更有利于實現起搏樣細胞的重編程，多種轉錄因子聯合作用將是后續研究生物起搏新的突破點。

與此同時，我們還需認識到ISL-1構建生物起搏器可能存在的不足。ISL-1作為胚胎性基因，在人類發育過程中，ISL-1只在特定的組織或器官中表達，例如胰腺和大腦。在成年后的組織或器官中高表達ISL-1，將抑制抑癌基因p14ARF等細胞周期調節因子的表達，促進細胞的自我更新，最終導致淋巴瘤、胃癌和膀胱癌等多種腫瘤的發生[27,28]。此外，ISL-1通過調節心臟的起搏及傳導，相關基因還可導致新的心臟傳導系統疾病及心律失常[29]。總之，ISL-1的生物安全性還有待進一步研究。

綜上所述，ISL-1作為一種與發育調控有關的重要轉錄因子，其在促進竇房結發育及維持竇房結起搏功能中扮演了重要的角色。ADSCs等種子細胞過表達ISL-1后可通過上調Tbx3、HCN4等SAN特異性基因，同時下調Nkx2.5等工作心肌特異性基因而使細胞形成If，最終分化為起搏樣細胞。鑒于ISL-1可參與對SAN特異性相關基因的表達調控，未來可將ISL-1作為生物起搏研究的重要誘導因子并深入探討其相應機制。但截止目前，由于生物起搏涉及的調控機制極其精確且復雜，該領域的研究還僅僅是在實驗的初期，ISL-1構建生物起搏器的穩定性、持久性及生物安全性問題仍需更進一步研究。