miRNA在胃腸道間質瘤發生發展及診治中作用的研究進展

姚志恒，錢波

安徽醫科大學第二附屬醫院，合肥 230000

胃腸間質瘤(GIST)是最常見的胃腸道間葉組織來源腫瘤，可發生于消化道的任何部位，以胃(約60%)和小腸(約35%)多見，也有少數病例可發生在消化道以外。現已證明，原癌基因c-kit和PDGFRA的獲得性突變是GIST發生的中心事件，但有關GIST的發病機制、早期診斷和耐藥等方面仍存在諸多難題。微小RNA(miRNA)是一種小的(21～25個核苷酸)非編碼RNA，其與胃癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤的發生發展密切相關。GIST作為常見的胃腸道腫瘤，miRNA在腫瘤細胞增殖、分化和凋亡等過程發揮重要作用。近些年來，有關miRNA與GIST發生發展、診斷、治療相關性的研究越來越多，發現兩者之間有密切的聯系。現就miRNA在GIST發生發展、診斷、治療中的作用研究進展情況綜述如下。

1 miRNA在GIST發生發展中的作用

1.1 miRNA與GIST增殖與遷移 魏偉等[1]通過miRNA芯片與RT-PCR技術對比檢測間質瘤細胞與正常細胞中的miRNA，顯示胃間質瘤有特異性的miRNA表達譜，通過上調miR-3178和miR-193a-5p的表達可能抑制間質瘤細胞增殖、促進凋亡。廖玉婷等[2]利用miRNA芯片及PCR技術從間質瘤細胞中篩選出10個差異性表達的miRNA，發現miR-301a表達上調最明顯，其表達量與性別、年齡、腫瘤發病部位等因素無關，與腫瘤危險度分級、腫物直徑、腫物細胞核分裂象和壞死情況相關，表明過表達miR-301a能顯著增強GIST細胞的增殖能力。Ling等[3]發現，miRNA-182在人GIST中的表達上調，其過表達增加了GIST-T1細胞的生長、增殖，減少凋亡，促進GIST細胞的集落形成和遷移。已有研究表明，miR-218能夠抑制骨肉瘤細胞的侵襲和遷移。Tu等[4]發現，miR-218在GIST中表達下調，其靶基因為KIT，通過負載納米顆粒的miR-218轉染，不僅可以提高表達的穩定性，而且對細胞增殖的抑制作用明顯增強。Yamamoto等[5]通過對19例GIST進行miRNA芯片分析，發現miRNA-133b在GIST中低表達，尤其是在高度惡性的間質瘤患者中下調更為明顯，進一步的作用靶點分析提示miRNA-133b下調后導致fascin-1(一種肌動蛋白結合蛋白)的過表達，fascin-1被證實促進腫瘤的增殖與轉移，該實驗證明下調miRNA-133b促進間質瘤細胞的轉移可能是通過上調fascin-1的表達實現的。張林等[6]發現，miR-376-3p在胃間質瘤中明顯下調，對轉染miR-376-3p后的間質瘤細胞通過Western blotting法和PT-PCR法、CCK8法、流式細胞儀、Transwell法分別檢測人類同源基因7(CASP-7)表達、細胞活性、凋亡率及遷移能力，結果顯示CASP-7 mRNA及蛋白水平顯著上調，細胞增殖、遷移能力明顯受到抑制，細胞凋亡增強。Isosaka等[7]使用TaqMan miRNA芯片分析miRNA表達譜、亞硫酸氫鹽焦磷酸測序分析DNA甲基化，發現miR-34a和miR-335表達下調，且它們的CpG島在GIST-T1細胞和大多GIST標本中被甲基化。轉染后高表達的miR-34a和miR-335，可以抑制GIST-T1細胞的增殖，并且miR-34a能夠抑制細胞的遷移和侵襲。

1.2 miRNA與GIST增殖凋亡的調控 Pantaleo等[8]使用miRNA微陣列對KIT/PDGFRA基因突變體和KIT/PDGFRA野生型GIST細胞株進行全基因組miRNA檢測，發現存在3個miRNA-mRNA潛在的調控網絡[IGF1R→miR-139-5p/miR-455/let-7b、周期蛋白依賴激酶6(CDK6)→miR-139-5p/let-7b和CD44→miR-330-3p]，其中miR-139-5p、let-7b、miR-455-5p、miR-330-3p在KIT/PDGFRA突變體GIST中表達上調。第1個IGF1R調節網絡中IGF1R是激素胰島素樣生長因子1的細胞表面受體，可引起細胞的過度增殖，通過上調miR-139-5p、miR-455、let-7b能夠調控IGF1R，抑制細胞的生長，其中前兩者起到主要的調控作用，后者作用相對次要；第2個CDK6調控網絡，CDK6作為一種細胞周期調節劑，可以促進哺乳動物細胞增殖，過表達的miR-139-5p、let-7b可以下調CDK6的表達，抑制細胞的增殖，提示在GIST中發揮腫瘤抑制因子的作用；第3個CD44調控網絡中，CD44是具有多種生物學功能的因子，可以通過多種途徑介導腫瘤生長和轉移，包括血管生成、細胞存活和細胞遷移，實驗發現miR-330-3p可以和CD44結合，可能抑制GIST細胞的增殖，促進細胞凋亡。miRNA可能通過直接調控CD44、CDK6等信號因子的表達，從而影響GIST的細胞學功能，促進或抑制腫瘤的生長轉移。Wang等[9]研究發現，miR-148b-3p在GIST中表達下調，進一步的靶基因預測分析顯示miR-148b-3p可以通過直接與KIT的3′-UTR結合來調控KIT表達，并且對細胞增殖、遷移和侵襲起抑制作用，研究還發現miR-148b-3p能與伊馬替尼產生協同抑制作用，增強細胞對伊馬替尼的敏感性。Liu等[10]發現，miR-137在GIST的臨床標本中表達顯著下調，miR-137的表達可以通過下調Twist1調控EMT從而減少GIST細胞遷移，導致G1細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡。Koelz等[11]發現，與其他腫瘤相比，miR-221和miR-222在大多數GIST中表達均下調，miR-221/222表達水平與KIT的表達密切相關，尤其是在KIT表達陰性和陽性腫瘤之間相關性更加密切，miR-221和miR-222的表達水平在KIT陽性的GIST中明顯受到抑制，而在KIT陰性的GIST中表達完全相反。Ihle等[12]研究認為，miR-221和miR-222可以降低細胞活力、誘導細胞凋亡、通過KIT/AKT信號級聯調控增殖。Yun等[13]通過分析三種miRNA(miR-221、miR-193a和miR-494)對KIT mRNA的下調效率，發現miR-494是惟一誘導KIT顯著下調的miRNA，進一步調控機制研究顯示，miR-494的抑制作用主要是通過直接作用于其靶基因KIT和Survivin，進而干擾細胞周期實現的。其中Survivin是miR-494的靶基因，其表達與miR-494在GIST組織中的含量呈負相關。Kim等[14]發現，GIST中miR-494表達下調，并且與KIT表達水平呈負相關，通過誘導miR-494過表達，可以下調KIT信號轉導通路下游分子AKT和STAT3的表達，導致細胞凋亡，并伴有G1期和S期細胞比例增加。

1.3 miRNA與GIST惡性度 肖軍等[15]通過對正常組織、低危GIST、高危GIST中miRNA的對比分析，發現miR-17-3p、miR-17-5p及miR-20a-5p在GIST中表達顯著下調，其中miR-17-3p、miR-17-5p在正常組織中的表達與腫瘤組織比較差異具有統計學意義，但是在低危組和中高危組GIST中表達無明顯差異；miR-20a-5p的表達在正常組織、低危組和中高危組GIST之間均有差異性，且隨著惡性度增加而表達下降，表明miR-17-3p、miR-17-5p、miR-20a-5p與腫瘤的侵襲、轉移與惡性度等相關，尤其miR-20a-5p在間質瘤的惡性轉歸中可能存在重要作用。姚冬雪等[16]發現，miRNA-206在胃間質瘤中表達下調，且在核分裂像≥5/50 HPF及Fletcher分級中/高危病例中miRNA-206下調更為明顯，其他病理因素(性別、年齡、腫瘤直徑)并沒有對miRNA-206的表達產生明顯影響，說明miRNA-206與胃間質瘤惡性度相關。Niinuma等[17]通過miRNA微陣列分析了32例GIST患者的miRNA表達譜，發現miR-186表達下調，尤其在轉移復發GIST中下調更明顯，表明該miRNA的下調促進了腫瘤細胞的遷移，與患者風險等級和預后不佳有關。Niinuma等[18]利用miRNA微陣列及PT-PCR技術對GIST標本進行分析，發現miR-196a在高危GIST中明顯上調，而在低危或中危GIST中明顯下調，表明miR-196a與GIST標本的高危分級、轉移和預后不佳可能相關。Gyvyte等[19]使用RNA測序法對15對GIST標本及其周圍正常組織進行了高通量miRNA分析，發現110個miRNA(上調34個，下調76個)在GIST中差異表達。選擇其中高表達的21個miRNA進一步研究，發現19個miRNA與GIST相關，其中6個miRNA(miR-133a-3p、miR-133b、miR-200c-3p、miR-509-3p、miR-483-5p、miR-675-3p)已經被證明在GIST中具有調控作用(前三者下調，后三者上調)，其余13個miRNA為新發現與GIST相關的，新發現的相關miRNA包括miR-200家族成員(miR-200c-3p、miR-200a-3p、miR-200b-3p、miR-429、miR-141-3)，這些家族成員在其他研究中顯示與腫瘤的預后和診斷相關，另外miR-192/215參與腫瘤相關p53網絡，miR-375在胃癌中下調，影響細胞增殖。miRNA富集分析發現，miR-141-3p的表達與KIT基因之間存在高度的負相關，而miR-375只表現為中度負相關，在富集的miRNA中只有miR-200a-3p與PDGFRA表現出顯著的負相關性。在miRNA與GIST組織學特性的實驗中，通過表型分析顯示miR-509-3p表達上調，尤其在上皮樣細胞和混合型細胞中高表達，miR-215-5p表達下調，且與GIST的危險程度呈中度負相關，已有研究顯示miR-215-5p在結腸癌和胰腺癌中發揮腫瘤抑制因子作用，成為預后不良的生物標志物。

2 miRNA在GIST診斷中的作用

2.1 miRNA與間質瘤良惡性鑒別 Shi等[20]通過基因芯片對差異性表達的miRNA篩選，結果顯示GIST惡性組與交界組相比，相差倍數2倍以上的miRNA有14個，上調的有5個(miRNA-720、miRNA-221、miRNA-130b、miRNA-10b、miRNA-135b)，下調的有9個(miRNA-326、miRNA-24-1、miRNA-145、miRNA-488、miRNA-218、miRNA-34a、miRNA-675、miRNA-335、miRNA-505)，其中表達差異最明顯的有4個，分別為miR-221(25.58倍)、miR-135b(25.35倍)、miR-675(5.69倍)、miR-218(66.56倍)。以往研究發現，miR-135b與結腸癌、前列腺癌相關；miR-675在結腸癌中起著癌基因的作用，并且可用于鑒別腎上腺皮質腺癌與腺瘤；miR-218可能與非小細胞肺癌、胃癌有關系；miR-221與GIST的惡性程度相關，且在其靶基因KIT陽性的GIST相較于KIT陰性的表達顯著降低。同樣地，Tong等[21]通過檢測不同類型GIST(良性、交界性、惡性)中miRNA表達譜，研究miRNA與GIST惡性進展間的關系，發現在GIST的惡性轉歸中存在多種miRNA的失調，let-7c、miR-218、miR-488、miR-4683、miR-34c-5p和miR-4773 這6個miRNA在良性GIST與惡性GIST中差異性表達，前四者在良性組中上調，后兩者下調；miR-29b-2、let-7c、miR-891b、miR-218、miR-204、miR-204-3p、miR-628-5p、miR-744、miR-29c、miR-625和miR-196a在邊緣組和惡性組中差異表達，miR-196a在邊緣組中下調，其余上調，let-7c、miR-218、miR-628-5p、miR-204、miR-891b、miR-488、miR-145、miR-891a、miR-34c-5p和miR-196a在非惡性組與惡性組中差異表達，非惡性組中低表達的只有miR-196a和miR-34c-5p，其余的miRNA高表達。在其他的腫瘤研究中發現，let-7c在惡性腫瘤中的低表達促進了細胞的增殖與轉移；miR-218可以負調控KIT蛋白的表達，抑制GIST細胞的增殖和侵襲；miR-34c下調了ULBP2的表達，降低了NK細胞對腫瘤細胞的識別能力，可能促進了腫瘤細胞的增殖與轉移；miR-196a在癌組織中的上調與腫瘤直徑、pT期、pN期及生存時間有關，miR-196a下調可抑制癌細胞增殖。上述實驗所篩選出的miRNA有可能成為鑒別間質瘤良惡性以及預后的生物學指標，為后續的治療提供了有力的臨床數據支持，但其檢測的準確度及靈敏度有待于進一步的研究。

2.2 miRNA與胃腸道內外間質瘤鑒別 林慧等[22]通過研究miRNA表達譜反映GIST與胃腸道外間質瘤(EGIST)關系，發現GIST腸道表型組與胃部表型組相比，有7個miRNA上調(miR-383、miR-1275、miR-193b、miR-139-3p、miR-663、miR-886-3p、miR-664)，有5個發生下調(miR-30e、miR-186、miR-10a、miR-199b-5p、miR-218)。比較GISTs和EGISTs的表達譜發現，僅有3個miRNA的表達差異具有統計學意義，提示GISTs和EGISTs的miRNA表型基本相似，也支持了絕大部分EGISTs實質上來源于GISTs的觀點。通過該實驗我們可以得知胃腸道很可能成為間質瘤的原發部位，并且轉移到胃腸道外。

3 miRNA在GIST治療中的作用

3.1 miRNA與伊馬替尼耐藥性檢測 Kou等[23]通過檢測繼發性伊馬替尼耐藥GIST患者、伊馬替尼敏感GIST患者和健康對照組血清miRNA表達譜，發現miR-518e-5p和miR-548e在繼發性伊馬替尼耐藥組血清中明顯增高，且miR-518e-5p對于伊馬替尼耐藥、敏感GIST患者以及正常對照組區分的靈敏度為99.8%，特異性為82.1%，與臨床病理特征(核分裂水平、轉移等)無相關性。該實驗表明血清miR-518e-5p可作為是一種潛在的生物標志物，成為早期檢測和診斷繼發性伊馬替尼耐藥GIST的新思路。

3.2 miRNA與伊馬替尼敏感性 Zhang等[24]利用微列陣分析發現了與伊馬替尼耐藥性相關的5個關鍵miRNA，在這5個miRNA中，與伊馬替尼耐藥靈敏度顯著相關的有miR-28-5p和miR-125a-5p。這2種miRNA的高表達，可以上調KEGG和GnRH信號通路的表達，進而影響GIST對伊馬替尼的藥物靈敏度，并且該miRNA的表達情況和GIST患者伊馬替尼治療效果密切相關。支小飛等[25]發現，伊馬替尼耐藥GIST細胞株中miRNA-145表達明顯下調，同時三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白亞家族C成員1(ABCC1)蛋白表達增多，轉染耐藥GIST細胞后高表達miRNA-145，ABCC1蛋白表達明顯下調，對于伊馬替尼靈敏度也顯著增強。提示miRNA-145可能通過下調ABCC1蛋白的表達，增加伊馬替尼耐藥GIST細胞的藥物靈敏度。Cao等[26]研究伊馬替尼耐藥GIST細胞中miRNA-21的表達，發現miRNA-21表達明顯下調，Bcl-2基因表達上調，通過轉染高表達miRNA-21，可以逆轉GIST細胞對伊馬替尼的耐藥，抑制細胞增殖，并且增加凋亡。相關機制研究提示，miRNA-21可能通過和Bcl-2基因的3′-未翻譯區(3′-UTR)結合，下調Bcl-2基因的表達，從而影響GIST細胞對伊馬替尼的靈敏度。Durso等[27]發現，通過上調miRNA-221/222的表達，可以增加GIST細胞對伊馬替尼的靈敏度，其機制可能是通過影響KIT基因的表達，增加細胞的凋亡和抑制細胞增殖。

3.3 miRNA與伊馬替尼耐藥 Shi等[28]通過基因芯片檢測GIST和伊馬替尼耐藥患者組織，發現表達差異的miRNA有10種，其中miR-1260b、miR-2964a-5p、miR-3907、miR-491-3p表達上調，miR-518a-5p、miR-4466、miR-595、miR-221-3p、miR-3145-3p、miR-3655表達下調。已有研究提示，miR-518a-5p可能起到抑癌因子的作用，進一步研究GIST中miR-518a-5p的功能，發現miR-518a-5p可以和PIK3C2A基因的3′-UTR結合，下調該基因的表達。在GIST耐藥細胞中，miR-518a-5p表達下調，可以上調PIK3C2A的表達，參與GIST對伊馬替尼的耐藥。石園等[29]利用基因芯片分析伊馬替尼耐藥GIST中的miRNA的表達，發現差異表達的miRNA有13種，其中表達差異最明顯的是miR-15a、miR-1280、miR-320a、miR-15a表達上調，后兩者表達下調，提示miR-15a、miR- 1280、miR-320a可能與GIST耐藥相關，但未作進一步的機制研究。不過在其他腫瘤中如胃癌，miR-15a可能通過作用于靶基因BCL-2、MCL1、ETS1、JUN等促進細胞凋亡、抑制細胞增殖；在膀胱癌中，miR-1280可通過調控靶基因ROCK1的表達，抑制膀胱癌侵襲與轉移；miR-320a可通過直接作用β-catenin抑制人結腸癌細胞增殖。Gao等[30]發現，miR-320a在伊馬替尼耐藥患者中低表達，該基因表達較低的患者，更易出現術后早期伊馬替尼耐藥。以上研究提示miRNA可能通過調控ABCC1、Bcl-2、PIK3C2A等基因表達，進而影響與凋亡相關的信號通路如Wnt通路、IGF通路、TRPC5等，抑制間質瘤細胞的凋亡，從而導致耐藥。

綜上所述，間質瘤是胃腸道常見的腫瘤之一，其生物學特性和癌癥有明顯差異，診斷和治療是現在研究的熱點。miRNA是一種非編碼RNA，被證實和間質瘤增殖、分化、凋亡等生物學功能相關，在診斷方面也有特殊的意義。今后，通過研究GIST中差異性表達的miRNA，進一步分析其作用靶點、作用機制及通路，對于闡釋GIST發生發展機制、輔助臨床診斷以及藥物治療等有著重要的臨床研究價值。