鼻咽癌放療抵抗機制的研究進展

吳麗芷，陳始明

武漢大學人民醫院，武漢 430060

鼻咽癌(NPC)是起源于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤，危險因素包括EB病毒(EBV)、人乳頭瘤病毒感染，遺傳易感性及飲食等生活習慣[1]。據流行病學調查統計顯示，2018年全球NPC的新發病例約有129萬例。調查還發現，NPC地理分布極不平衡，近70%以上的新發病例發生在東亞和東南亞地區[2]。由于鼻咽部解剖結構復雜，且周圍鄰近重要器官，故難以進行手術根治性切除。且NPC的病理類型絕大多數為非角化型未分化性癌，惡性程度高，易發生頸部淋巴結轉移。由于對電離輻射(IR)高度敏感，因此放射治療是目前NPC首選的治療手段[3]。然而，大量研究表明，IR殺滅腫瘤的同時也可以誘導許多基因和蛋白質表達水平的變化，這些變化可導致腫瘤對IR的敏感性降低，并出現輻射抗性或輻射抗性的發展。放射抗性是NPC治療失敗的主要原因[4]。因此，探索NPC放射抗性的分子機制對于提高NPC放射治療效果乃至改善NPC患者預后至關重要。

放療抵抗的產生是一個多基因和多機制共同參與的過程，包括具有高度致瘤原性的腫瘤干細胞(CSC)，通過激活DNA損傷修復抗凋亡；腫瘤細胞葡萄糖攝取增加、線粒體氧化磷酸化減少，以高效修復DNA；通過自噬提供能量和消除已經被輻射損傷的蛋白質促進細胞存活；調控細胞周期重新分布，使其對放療敏感性減弱；且EBV編碼的潛伏膜蛋白1可誘導NPC CSC形成[5]。現將NPC放療抵抗機制的研究進展情況綜述如下。

1 CSC

1983年，Mackillop等[6]最先提出CSC的概念，認為其是腫瘤細胞中一類具有干細胞特性的異質性細胞。但是，與其他腫瘤細胞不同的是腫瘤干細胞具有無限的自我更新能力和高度的致瘤原性，這些特性使CSC成為腫瘤生長和復發的根源。因此，CSC是腫瘤診斷，治療及預測預后的重要標志，也是癌癥治療的新靶標[7]。Krause等[8]提出，CSC通過多種機制介導癌癥中放射抗性的發生，例如激活DNA損傷修復及抗凋亡途徑，清除活性氧防止不可逆的氧化應激和細胞死亡，以及改變腫瘤微環境等。

Zhong等[9]在研究RARS-MAD1L1在NPC放療抵抗中的作用和機制中發現，RARS-MAD1L1過表達將增加NPC細胞的集落形成能力和體外致瘤性，增加側群細胞(一群富含CSC的群體)比率并誘導放療抵抗。此外，RARS-MAD1L1可以抑制AIMP2從ARS復合物中釋放，減少TRAF2的泛素化，導致NF-κB活性升高，抑制細胞凋亡[10]。FUBP1的沉默或c-Myc抑制劑的使用可以消除由RARS-MAD1L1誘導的CSC特征。Wang等[11]在NPC細胞系中篩選出干細胞樣亞群(PKH26+)，PKH26+亞群中c-Myc的過表達導致CHK1和CHK2的表達增加，并隨后激活DNA損傷檢查點，引起細胞周期停滯，激活相關DNA損傷修復蛋白從而引起放療抵抗。

CSC特異性治療是一種非常有前景的腫瘤靶向治療。CSC的潛在靶向可以以不同的方式實現，包括靶向CSC相關分子，干擾促進CSC功能的環境或抑制對CSC維持和存活至關重要的分子途徑。然而，由于大多數CSC標記物在正常組織干細胞中也有表達，因此CSC靶向治療可能影響正常組織干細胞的信號傳導機制，導致產生嚴重的副作用進而影響其臨床使用[12]。

2 腫瘤細胞代謝

越來越多的研究報道證實，放射抵抗的產生與癌細胞的代謝改變相關。放射抵抗的癌細胞表現出Warburg效應，即葡萄糖攝取增加和線粒體氧化磷酸化減少[13～15]。AMPK是癌細胞中Warburg效應的負調節因子，Lu等[16]通過激活NPC細胞中的AMPK抑制Warburg效應后發現NPC細胞體內、體外的放射敏感性均得到明顯增強。此外，谷氨酰胺代謝也被證明在放射抗性中起關鍵作用。谷氨酸是谷胱甘肽合成的前體，其可以調節氧化還原穩態，從而有助于細胞防御系統。有研究發現，谷氨酸的抑制可顯著增加癌細胞的放射敏感性，證實谷氨酰胺代謝在放射抗性中的起了重要作用[17]。研究[17]證實，在抗輻射NPC細胞中谷氨酰胺合成酶高表達，從而促進其核苷酸生物合成并進行更高效的DNA修復，以獲得生存優勢和抗輻射的特點。

3 DNA損傷修復

放射治療主要是通過IR直接或間接地損傷癌細胞DNA，引起癌細胞堿基破壞、DNA雙鏈或單鏈斷裂。不同類型的DNA損傷可被相應的DNA修復機制修復，如堿基切除修復、DNA雙鏈斷裂修復、核苷酸切除修復及錯配修復。由于DNA雙鏈斷裂是最嚴重的損傷，且較其他損傷更難以修復，DNA雙鏈斷裂后未修復或者錯誤修復均會導致細胞死亡或者惡變[18]。細胞暴露于IR會導致核中的表皮生長因子受體(EGFR)活化，活化后的EGFR通過非同源性末端接合(NHEJ)和同源重組(HR)刺激DNA雙鏈斷裂修復。You及其團隊選取Ⅱ～Ⅳb期NPC患者1 628例，將其分為兩組，對照組采取放化療治療，觀察組在對照組基礎上加用抗EGFR靶向治療，結果顯示與單純放化療相比放化療聯合抗EGFR靶向治療可顯著提高Ⅱ～Ⅳb期NPC患者的總生存時間，并且改善了無遠處轉移生存率[19]。通過研究RBM3在NPC患者病理組織標本中的表達情況發現，高RBM3表達的NPC患者往往伴有放療抵抗[20]。同時檢測出抗輻射NPC細胞CNE1R中RBM3的表達較親代CNE1細胞群RBM3的表達明顯上調。進一步研究發現，下調NPC細胞中的RBM3水平可以在體內和體外明顯提高其放射治療敏感性，這可能與RBM3激活PI3K/AKT/Bcl-2信號通路有關，因為Bcl-2的上調減少了IR引起的DNA損傷。

近年來，抗DNA損傷修復(DDR)已經成為腫瘤藥物開發的一個熱點。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制劑是目前研究最廣泛的DDR抑制劑，其通過結合到PARP1和(或)PARP2的NAD+結合口袋，引起構象異構，造成DNA-PARP的不可逆解離，使PARP保持對DNA的結合，這個過程被稱為DNA-PARP復合物的“捕獲(誘捕)”，這導致DNA-PARP復合物長期存在，無法進行后續的修復，從而提高腫瘤細胞的放療敏感性[21]。目前，PARP抑制劑的臨床試驗適應癥研究已經擴展到肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、頭頸部腫瘤等[22]。

4 自噬

自噬是細胞在面對能量缺乏，暴露于細胞毒性物質或IR等應激狀態時，通過溶酶體降解細胞內受損的蛋白質或者細胞器，維持細胞內環境的穩態的一種自我保護機制，包括大自噬、微自噬、分子伴侶介導的自噬[23]。自噬在腫瘤發生和發展中的作用是復雜和矛盾的。一方面，自噬通過消除細胞中錯誤折疊的蛋白質來抑制腫瘤的發生。另一方面，在腫瘤進展的晚期，自噬通過提供能量和消除已經被藥物和輻射損傷的蛋白質來促進細胞存活[24]。許多研究表明，自噬通過減少細胞損傷和抑制輻射誘導的細胞凋亡來促進輻射后細胞的存活，是各種腫瘤放射抵抗的基礎，包括肺癌[25]、肝細胞癌[26]和結腸直腸癌[27]。Liang及其團隊使用體外分次輻射的方法構建出抗輻射的NPC細胞系CNE-2R，對其分別進行自噬抑制及激活的處理，實驗結果顯示：放療聯合自噬抑制劑顯著抑制了CNE-2R細胞的增殖，促進其凋亡。相反，自噬的激活導致放射抵抗產生[28]。此外還有文獻[29]報道，LAPTM4B是自噬的關鍵調節因子，其通過與EGFR、Beclin1相互作用介導自噬的起始。敲低LAPTM4B可以降低放射抵抗細胞的存活率，并且在IR后增加其凋亡的發生。

5 細胞周期調控

細胞周期是指細胞從一次分裂結束開始，到下一次分裂完成所經歷的過程，它受細胞周期蛋白(Cyclin)、周期蛋白依賴性激酶(CDK)、周期蛋白依賴性激酶刺激抑制因子(CKI)等多種特異性蛋白的調控[30]。細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是調控細胞周期中G1期的關鍵蛋白之一，Cyclin D1高表達與腫瘤的發生、發展有重要關系，其通過變構調控細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)和CDK6，調節細胞周期從G1期向S期轉變[31]。

細胞對放射治療的敏感性與細胞周期的關系非常密切，活躍分裂的腫瘤細胞更容易受到輻射的傷害，因此細胞在G2期～M期間對輻射最敏感，在晚期S期對輻射最不敏感[32]。有研究[33]表明，SHP-1(含SH2結構域的蛋白質酪氨酸磷酸酶1)通過上調CyclinD1的表達促進NPC細胞從G1期提前進入S期，加快NPC細胞增殖。利用shRNA技術降低內源性SHP-1表達后，NPC細胞成瘤能力和侵襲轉移能力顯著減弱，放療敏感性增強。這提示SHP-1基因沉默有可能通過調節CyclinD1的表達影響NPC細胞的細胞周期分布，增加其放療敏感性。

胎盤特異蛋白8(PLAC8)是一種富含半胱氨酸的蛋白，它首次發現于人類胎盤組織中，與人體內多種腫瘤的發生有密切關系。研究[34]發現，PLAC8體內及體外均具有促進NPC細胞侵襲和轉移的作用，其分子機制是特異性激活TGF-β/SMAD信號通路并誘導NPC細胞上皮間質轉化。我們對PLAC8與NPC的放療敏感性也進行了深入研究，發現敲除PLAC8基因的NPC細胞在放射治療后的凋亡數目顯著上升，G2/M期細胞比例也上升；敲除PLAC8基因可顯著提高NPC細胞的放療敏感性[35]。這些研究為包括放療增敏在內的NPC靶向治療提供了新的方向。

6 EBV

EBV是γ皰疹病毒家族的成員之一，在全世界感染率極高，血清檢測陽性率高達90%以上。NPC的發生與EBV的感染密切相關。研究[36]證實，EBV所編碼的miR-BART4在NPC中抑制PTEN的表達，進而促進NPC轉移，抑制細胞凋亡，導致放療抵抗。潛伏膜蛋白1(LMP1)是EBV編碼的主要癌蛋白[37]。據報道[38]，LMP1激活PI3K/AKT信號通路刺激CSC標記物的表達，誘導NPCCSC特性的形成。同時PI3K/AKT這一信號通路也被LMP1誘導的CSC標記物激活，形成一正反饋效應。此外，EBV還分泌多種抗凋亡蛋白，如BHRF1、BARF1、EBNA1、ERER、miR-BART，這些均導致NPC細胞對放療產生抵抗[39]。還有研究[40]表明，LMP1上調己糖激酶2的表達，促進NPC細胞進行有氧糖酵解，并顯著抑制線粒體依賴的細胞凋亡，以此為靶向抑制LMP1表達可使NPC細胞放射增敏性提高。

綜上所述，CSC、DNA損傷修復、代謝、自噬、細胞周期調控及EBV是NPC放療抵抗的相關機制，在以后的NPC放射治療中，我們可以選擇合適的靶向藥物，特別是針對NPC CSC及DNA修復途徑的蛋白質，與放射治療聯合使用，以期探索出逆轉放療抵抗的干預措施，從而開發出提高NPC放療療效、降低NPC復發和轉移的新途徑。這也將是NPC未來研究的難度與熱點之一。