枸杞葉多糖提取工藝優化及其緩解小鼠過敏性鼻炎的研究

趙嘉慶，肖靜，史春麗，王立英， 何斌，高小平

1(寧夏醫科大學總醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，寧夏 銀川，750004)2(寧夏回族自治區醫學科學研究所，寧夏 銀川，750004) 3(寧夏醫科大學 基礎醫學院，寧夏 銀川，750004)4(寧夏森淼枸杞科技開發有限公司，寧夏 銀川 750000)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是世界上最常見的慢性炎癥性疾病之一，嚴重影響個人生活質量。數據顯示，過敏性鼻炎影響著世界上10%～40%的人口[1]。在一些西方國家，大約有900萬人深受其害，它嚴重損害睡眠質量和認知功能，使人變得易怒和疲勞，降低人們的生活質量和工作學習表現[2-3]。作為一種過敏性疾病，AR是由免疫球蛋白E(immunoglobulins E，IgE)介導的適應性免疫應答引起的，淋巴細胞，肥大細胞，嗜酸性細胞之間復雜的相互作用在其發生發展中均發揮著作用，多種炎性細胞浸潤為AR的主要特征[4-5]。Th1/Th2細胞比例失衡被認為是過敏性疾病發病的重要誘因之一[6]。當易感人群暴露于過敏原時，Th2細胞分泌IL-4，B細胞產生IgE,嗜酸性粒細胞活化釋放一系列促炎因子引起以鼻部癥狀為特征的疾病，臨床上主要表現為鼻塞、打噴嚏、鼻癢和流鼻涕等癥狀[7-8]。有研究表明糖皮質激素是控制這種過敏性疾病炎癥方面最有效的藥物，雖然激素在減輕炎癥方面效果顯著，但是它強大的抗炎作用往往也帶來了嚴重的副作用[9]。故而在緩解炎癥的同時尋求新的、溫和的治療手段來治療AR尤為迫切。

枸杞是一種傳統的中藥，同時還作為食品補充劑普遍應用于人們的日常保健[10]。它富含枸杞多糖、甜菜堿、酚類、類胡蘿卜素、腦苷、黃酮和維生素等多種物質，其中枸杞多糖是枸杞的主要活性成分[11]。有文獻報道從枸杞果中提取的多糖可能與枸杞具有抗氧化、抗衰老、神經保護、細胞保護、免疫調節等多種生物活性有關[12]。在一項實驗研究中表明LBP對環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)誘導的小鼠具有免疫調節作用，枸杞多糖能保護免疫器官(提高免疫器官指數，減輕免疫器官損傷)，促進免疫相關細胞因子的產生，增強宿主免疫系統[13]。本實驗主要以達到枸杞葉多糖最佳提取得率為目的，優化枸杞葉多糖的提取工藝，并探究LBP對過敏性鼻炎小鼠的免疫調節作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

1.1.1 動物

30只雌性C57BL/6小鼠(購自北京維通利華實驗動物公司)，經過1周檢疫期后，飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心SPF級的動物房中，實驗動物均符合動物倫理委員會的要求。

1.1.2 材料與試劑

寧杞9號天精菜，森淼公司；卵清蛋白(ovalbumin，OVA), Sigma公司；氫氧化鋁凝膠, Thermo公司；HE染色試劑盒、PAS染色試劑盒、MPO染色試劑盒、甲苯胺藍染色試劑盒，北京博奧拓達科技有限公司；紅細胞裂解液、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的CD4、別藻藍蛋白(allophycocyanin,APC)標記的CD3、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標記的IL-4、多甲藻黃素-葉綠素蛋白-花青素5.5(peridinin-chlorophyll-protein complex-cyanine 5.5，PerCP-Cy5.5)標記的IFN-γ，Biolegend。

1.2 儀器與設備

LDZX-75KBS蒸汽滅菌高壓鍋，山東博科科學儀器有限公司；SJ-CJ-2FD超凈工作臺，蘇潔醫療有限公司；BX43光學顯微鏡,深圳市三利化學品有限公司；TS-NS-300中試水提醇沉設備，上海順儀實驗設備有限公司；710-ES等離子體發射光譜儀，美國瓦里安；UPT-I-40L超純水器，成都優普；BD FACS Celesta流式細胞儀，美國BD Biosciences。

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞葉多糖的提取工藝

本次實驗以寧杞9號天精菜為原料，在前期對單因素篩查結果的基礎上，以提取液料比、溫度、時間作為影響因素，以枸杞葉多糖提取率作為衡量指標進行正交優化實驗(3因素3水平)對枸杞葉多糖進行提取。

1.3.2 枸杞葉多糖含量

根據最優的提取工藝參數，以寧杞9號天精菜為原料，制備枸杞葉多糖并測定其多糖含量。

1.3.3 OVA誘導的過敏性鼻炎小鼠模型的構建

為構建疾病模型，每只小鼠1周腹腔注射1次200 μL OVA致敏液[內含100 μg OVA與4 mg Al(OH)3]致敏，連續3次；致敏結束一周后，每只小鼠用50 μL的OVA激發液(1 mg/mL)連續滴鼻一周激發，以完成過敏性鼻炎小鼠模型的構建。對于LBP干預組，在建立哮喘模型前2周開始先給小鼠每天灌胃LBP 300 μL(100 mg/kg)直至小鼠處死，對照組小鼠每天以生理鹽水代替LBP。

1.3.4 實驗分組

將30只雌性C57BL/6小鼠隨機分為3組，分別為對照組，過敏性鼻炎模型組，LBP干預過敏性鼻炎組。

1.3.5 小鼠鼻部癥狀評分

末次滴鼻致敏后觀察小鼠30 min內抓鼻、打噴嚏的次數以及流涕癥狀進行小鼠鼻部癥狀評分，總分>5認為造模成功。記分標準[14]如下：(1)搔鼻1～2次，記為1分；劇烈撓鼻不止，記為3分；介于二者之間，記為2分。(2)噴嚏，1～3個，記為1分；4～10個，記為2分；>11個，記為3分。(3)流涕，流至前鼻孔，記為1分；超出前鼻孔；記為2分；涕流滿面，記為3分。

1.3.6 鼻黏膜炎癥細胞染色

將小鼠鼻前部組織用40 g/L多聚甲醛固定，多層脫水后制作石蠟切片，同時進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、過碘酸-希夫(periodic acid-schiff stain，PSA)染色、甲苯胺藍染色、髓過氧化物酶(myelpoperoxidasedficiency，MPO)染色后觀察鼻黏膜組織結構，以及杯狀細胞，肥大細胞，嗜酸性粒細胞浸潤。

1.3.7 脾臟細胞懸液Th細胞比例

向小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，取小鼠脾臟，加完全培養基經300目尼龍網膜研磨過濾得單細胞懸液。隨后將得到的細胞懸液用紅細胞裂解液處理去除殘留的紅細胞，PBS洗滌2次后，牛鮑式計數板計數并調整濃度為1×107個/mL,并加入胞內因子刺激劑37 ℃，5%(體積分數)CO2培養5 h。取100 μL細胞懸液加入1 μL FITC標記的抗小鼠CD4抗體，2 μL APC標記的抗小鼠CD3冰上避光孵育30 min，加入PerCP-Cy5.5標記的IFN-γ以及PE標記的IL-4邊破膜邊染色，室溫孵育30 min，經染色緩沖液洗滌后，100 μL多聚甲醛重懸細胞并用流式細胞儀分析Th1細胞(CD3+CD4+IFN-γ+)和Th2細胞(CD3+CD4+IL-4+)百分比。

1.3.8 統計學分析

使用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計學分析，各組實驗數據均用均數±標準差表示，組間差異顯著性判斷采用單因素方差分析，若有統計學意義,則進行組間比較,采用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 枸杞葉多糖的提取工藝研究

通過開展以提取時間、溫度、料液比作為影響因素，以枸杞葉多糖提取率作為衡量指標進行正交優化實驗(3因素3水平)對枸杞葉多糖進行提取，最終確定的枸杞葉多糖最優提取工藝為提取時間8 h，提取溫度50 ℃，料液比1∶25(g∶mL)。此條件下得到的枸杞葉多糖提取率最高達到9.61%。正交實驗結果如表1所示。

表1 枸杞多糖提取率正交實驗結果以及方差分析Table 1 Orthogonal experiment and variance analysis of extraction rate of LBP

由表2可知，極值R(B)>R(C)>R(A)，從而得出影響枸杞葉多糖提取率的主次因素依次為提取溫度、料液比、提取時間。正交實驗結果表明，各因素不同水平的最佳配比為A1B2C2。即提取時間為8 h，提取溫度為50 ℃，料液比為1∶25(g∶mL)。此條件下得到的枸杞多糖提取率最高，質量較優。

表2 枸杞葉多糖提取率方差分析Table 2 Analysis of variance of extraction rate of LBP

2.2 枸杞葉多糖成分測定

2.2.1 枸杞葉中多糖的測定

根據最優的提取工藝參數，制備枸杞葉多糖，并對其中標志性有效活性成分進行含量測定。結果表明枸杞葉多糖中多糖的含量為61.27%，其含量測定標準曲線方程及測定結果見表3和表4。

2.2.2 枸杞葉多糖中甜菜堿含量測定

同樣以最優提取工藝參數，對枸杞葉多糖中甜菜堿含量進行測定，結果表明枸杞葉多糖中甜菜堿的平均含量約為2.71%。具體的含量測定標準曲線方程及測定方法見表5和表6。

表3 枸杞葉多糖中多糖含量測定標準曲線方程Table 3 Standard curve equation for the determination of polysaccharide content in LBP

表4 枸杞葉多糖中多糖含量測定結果 Tab.4 Determination of polysaccharide content in LBP

表5 枸杞葉多糖中甜菜堿含量測定標準曲線Table 5 Standard curve for determination of betaine content in LBP

表6 枸杞葉多糖中甜菜堿含量測定結果Table 6 Determination of betaine content in LBP

2.2.3 枸杞多糖中氨基酸、礦物質含量測定

本課題組對枸杞多糖中氨基酸、礦物質測定的詳細結果已有報道，其中常量元素Ca、P、Mg、K、Na的含量分別為0.095%、2.57%、2.89%、4.39%、1.00%，天冬氨酸以及谷氨酸分別為1.86%和1.17%[15]。

2.3 LBP改善過敏性鼻炎小鼠的常規狀態

經過OVA誘導的致敏組小鼠頻繁撓鼻，煩躁好動。3組小鼠的行為生物學表明：與對照組相比，過敏性鼻炎模型組的小鼠撓鼻次數明顯增加，多次出現噴嚏及水樣鼻涕，并且出現呼吸頻率加快的現象，這些現象均表明模型構建成功；LBP干預過敏性鼻炎組與過敏性鼻炎模型組相比，LBP干預后小鼠的撓鼻次數減少，出現水樣鼻涕及噴嚏的次數減少，呼吸頻次相對緩和，以上現象說明LBP可以緩解過敏性鼻炎小鼠的過敏性癥狀。綜上所述，從小鼠的行為生物學來看，過敏性鼻炎模型組小鼠的鼻炎癥狀最重，經過LBP干預后，小鼠的常規狀態明顯好于過敏性鼻炎模型組，這提示LBP可改善過敏性鼻炎小鼠的過敏狀態。同時對小鼠的鼻部癥狀進行評分如表7所示。

表7 各組小鼠鼻部癥狀評分Table 7 Nasal symptom score in each group

2.4 LBP減輕過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜炎癥細胞浸潤

2.4.1 LBP減輕鼻黏膜炎癥水平

鼻黏膜固有層為疏松結締組織，包括肥大細胞，嗜酸性粒細胞，淋巴細胞等多種炎癥細胞，還有豐富的血管和腺體，鼻黏膜靜脈叢發達[16-18]。正常情況下靜脈叢呈收縮狀態，受刺激后可反射性擴張充血引起鼻塞，靜脈叢破裂還有可能引起鼻部出血;腺體的分泌物可以潤滑鼻黏膜，黏附細菌和異物，在病理條件下，腺體分泌增加臨床上可表現為清涕。HE染色3組鼻黏膜的結果見圖1，對照組的鼻黏膜假復層纖毛柱狀上皮細胞核呈2層或者3層，排列整齊，黏膜下少量淋巴細胞浸潤，黏膜下腺體呈正常生長狀態。與對照組相比，哮喘模型組的鼻黏膜假復層纖毛柱狀上皮明顯增厚，且黏膜下大量炎癥細胞浸潤，毛細血管擴張，有大量空泡狀胞漿疏松區域，為黏膜下腺體增生從而分泌的黏液或者漿液。與過敏性鼻炎模型組相比，LBP干預組的鼻黏膜假復層纖毛柱狀上皮增厚程度明顯減輕，黏液腺體增生程度減少。

a-對照組;b-過敏性鼻炎模型組;c-LBP干預過敏性鼻炎組圖1 三組小鼠鼻黏膜HE染色Fig.1 HE staining of nasal mucosa in three groups

2.4.2 LBP減輕鼻黏膜杯狀細胞浸潤

鼻黏膜上皮主要由柱狀細胞，杯狀細胞和基細胞組成，杯狀細胞增生會引起黏液分泌過多[19]。用PAS將杯狀細胞染成紫紅色，3組PAS染色的結果如圖2所示(杯狀細胞如下圖箭頭所示)，杯狀細胞一般呈散在分布，當有炎癥發生時杯狀細胞胞內充滿黏原顆粒，局部增大，當黏原顆粒釋放后可參與上皮表面黏液毯的形成。與對照組形成相比，過敏性鼻炎模型組有大量散在分布的杯狀細胞，且細胞呈典型的高腳杯狀，胞核位于底部，胞質充滿紫紅色黏液顆粒，且黏液呈噴射狀向腔面隆起。杯狀細胞作為黏膜免疫的一種“哨兵”可以分泌黏液來維持黏膜穩態和抵御感染，是免疫系統不可或缺的細胞[20-21]。然而過多的黏液分泌會造成臨床上以鼻塞等為特點的過敏性癥狀，采取一定的措施降低過敏性鼻炎患者杯狀細胞的數量會一定程度緩解病人的痛苦。在經過LBP干預后，觀察過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜中陽性杯狀細胞的數量明顯減少，這為我們在治療過敏性鼻炎策略上提供了新思路。

a-對照組;b-過敏性鼻炎模型組;c-LBP干預過敏性鼻炎組圖2 三組小鼠鼻黏膜PAS染色Fig.2 PAS staining of nasal mucosa in three groups

2.4.3 LBP減輕鼻黏膜肥大細胞浸潤

肥大細胞是炎癥細胞因子、蛋白酶、血管內皮生長因子和肥大細胞特異性介質的豐富來源，在炎癥中促進組織結構重塑[22]。有研究表明，在哮喘這種過敏性疾病中，肥大細胞是處于“激活”狀態的，這種不當的激活會使肥大細胞重新分布到特定的部位從而介導有害性的組織重塑過程[23]。在過敏反應的早期和急性階段，肥大細胞被認為是過敏反應的效應細胞，特異性IgE與肥大細胞表面IgE受體結合促進肥大細胞釋放組胺等過敏性介質使得血管通透性增加、平滑肌收縮和黏液分泌[24]。肥大細胞是異染細胞，其胞質內含有肝素和組胺等異色物質遇到甲苯胺藍可呈異染性紫紅色[25]。3組甲苯胺藍染色結果見圖3(肥大細胞如下圖箭頭所示)：對照組黏膜下層和黏膜間質中基本沒有肥大細胞浸潤。過敏性鼻炎模型組黏膜下可見染成紫紅色的肥大細胞，有些肥大細胞胞膜不完整，有些細胞呈空泡狀，胞質著色不均勻，肥大細胞周圍可見脫出的顆粒物質。與過敏性鼻炎模型組相比，LBP干預組肥大細胞數量減少，由此可見LBP可以減少肥大細胞在小鼠鼻黏膜中的浸潤，具備改善小鼠過敏性炎癥的潛能。

a-對照組;b-過敏性鼻炎模型組;c-LBP過敏性鼻炎干預組圖3 三組小鼠鼻黏膜甲苯胺藍染色Fig.3 Toluidine blue staining of nasal mucosa in three groups

2.4.4 LBP減輕嗜酸性粒細胞浸潤

嗜酸性粒細胞在先天性免疫和獲得性免疫中均發揮重要的作用，它可以作為抗原提呈細胞處理抗原，通過產生T細胞極化細胞因子刺激T細胞，通過與B細胞相互作用促進體液免疫反應，由此可見嗜酸性粒細胞具有免疫調節能力[26]。作為一種終末效應細胞，嗜酸性粒細胞可以釋放陽離子蛋白、細胞因子、趨化因子發揮作用，然而過多的效應細胞會造成組織損傷[27-29]。對嗜酸性粒細胞進行MPO染色，細胞內陽性顆粒呈棕黃色或者藍黑色，3組MPO染色結果如圖4所示(嗜酸性粒細胞細胞如下圖箭頭所示)：過敏性鼻炎組鼻黏膜固有層可見大量的嗜酸性粒細胞浸潤，經過LBP干預后，小鼠鼻黏膜中棕黃色的陽性細胞數明顯減少。嗜酸性粒細胞是重要的免疫效應細胞和炎性細胞，是介導炎癥反應的主要細胞因子之一[30]。經過LBP干預后鼻黏膜嗜酸性粒細胞減少這表明LBP可以減輕過敏性鼻炎小鼠的炎癥反應，實現對小鼠過敏性鼻炎的緩解作用。

a-對照組;b-過敏性鼻炎模型組;c-LBP干預過敏性鼻炎組圖4 三組小鼠鼻黏膜MPO染色Fig.4 MPO staining of nasal mucosa in three groups

2.4.5 脾臟Th1/Th2細胞比例變化

在機體免疫系統細胞中，T淋巴細胞的子集輔助性T(Th)細胞是免疫調節的關鍵調節點，Th1/Th2細胞平衡紊亂在過敏性疾病以及多種自身免疫病中均有報道，主要表現為Th2細胞相關的細胞因子升高[31-32]。Th細胞可以根據其細胞因子譜進行區分從而賦予Th亞型不同的功能特性，Th1細胞相關的細胞因子是IFN-γ和TNF；Th2相關的細胞因子是IL-4、IL-5和IL-13[33]。脾臟是機體重要的免疫器官，以CD3+細胞畫門，對小鼠脾臟淋巴細胞Th1(CD4+、IFN-γ+)，Th2(CD4+、IL-4+)細胞進行流式細胞術分析如圖5、圖6所示(Th1/Th2細胞比例如圖5、圖6右側)，在過敏性鼻炎模型組中Th1細胞比例為1.1%，Th2細胞比例為1.7%，與對照組Th1細胞比例3.8%，Th2細胞比例0.8%相比具有顯著差異。在過敏性鼻炎模型組中Th2細胞比例增高，Th1細胞比例下降這與其他報道中過敏性疾病Th1/Th2細胞比例失衡一致[6]。經過LBP干預后Th1細胞比例為5.5%，Th2細胞比例為0.6%，上述結果表明LBP具有調節Th細胞免疫應答的功能。

a-對照組；b-過敏性鼻炎模型組；c-LBP干預過敏性鼻炎組圖5 三組小鼠脾臟Th1細胞比例Fig.5 Proportion of Th1 cells in spleen of mice in the three groups注：*代表每組分別與b組相比P<0.05(下同)

a-對照組；b-過敏性鼻炎模型組；c-LBP干預過敏性鼻炎組圖6 三組小鼠脾臟Th2細胞比例Fig.6 Proportion of Th2 cells in spleen of mice in the three groups

3 結論

本次實驗以提取時間8 h，提取溫度50 ℃，料液比1∶25(g∶mL)為條件得到的枸杞葉多糖提取率最高。觀察小鼠的生存狀態發現，經過LBP干預后過敏性鼻炎小鼠的撓鼻次數，打噴嚏的次數較過敏性鼻炎模型組均減少。對小鼠的鼻黏膜進行組織化學染色后發現，LBP干預后可以減少小鼠鼻黏膜炎癥細胞的浸潤，初步證實了LBP可以緩解過敏性鼻炎小鼠。流式細胞術分析Th1/Th2細胞比例同時證實了LBP可以糾正Th細胞的失衡，具有調節小鼠免疫系統的功能。過敏性鼻炎和過敏性哮喘均屬于過敏性疾病，有研究表明LBP可以從減輕氣道炎癥和調節腸道菌群這兩個方面來改善過敏性哮喘[15]。這與我們此次實驗得到的結論是相吻合的，在本次實驗中我們雖然證實了LBP可以緩解過敏性鼻炎，但是其作用機制目前仍然不清楚，有待進一步的研究。