酶法輔助共發酵奶啤的工藝優化

郭水連，趙曉晴，莊鈺蓉，黃燕燕，余佳佳，趙珊，劉冬梅

(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510641)

奶啤是一種以全脂或脫脂乳為原料，經乳酸菌、酵母發酵而成的具有酸奶與啤酒糅合后的獨特香氣的低酒精乳飲料[1-2]，其風味主要由微生物酶分解乳制品中蛋白質、脂肪和碳水化合物而產生的醇類、酯類、醛類、酸類、酮類組成[3]。

酶法輔助生產在制取功能性多肽、提高澄清度等[4-5]方面應用廣泛。蛋白水解產物對德氏乳桿菌及嗜熱鏈球菌有增殖作用，隋欣等[6]表明蛋白水解酶處理后的脫脂奶培養基適宜乳酸菌混合菌株的生長。由于酶水解液含有大量苦肽，奶酪中常添加外肽酶來消除苦味，如氨肽酶等[7]。

奶啤通常由乳酸發酵及酒精發酵兩步制成，而本試驗讓兩者同時發酵。發酵過程中菌株的含量、種類及比例關系對奶啤風味有一定程度的影響。付鴻等[8]表明乳酸單菌發酵沒有混合菌效果好,以桿菌和球菌按(1～2)∶1混合制得酸奶口感最佳。洪家麗等[9]表明乳酸菌因能顯著提高酵母菌有機酸含量而促進其生長。顧悅等[10]表明釀酒酵母因提高發酵乳中游離氨基氮、蘋果酸等含量和酒石酸等生成速率而促進屎腸球菌的生長。

本文采用共發酵酶解乳液制備新型奶啤，考察不同酶種類、酶活、桿菌和球菌比例、酵母含量等因素對奶啤發酵的影響，并通過Box-Behnken試驗確定奶啤的最佳工藝，為新型奶啤的商業化生產奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉，雀巢(中國)有限公司；嗜熱鏈球菌(DMST-H2，保藏編號GDMCC NO.60642)、德氏乳桿菌(DMLD-H1，保藏編號GDMCC NO.6045)，實驗室保藏；安琪牌酵母，市售菌株；低聚果糖(95%)，江門量子高科生物股份有限公司公司；菠蘿蛋白酶(CAS：9001-00-7)、木瓜蛋白酶(CAS：9001-73-4)、中性蛋白酶(Neutrase 0.8 L)，諾維信(中國)生物技術有限公司；白砂糖，市售食品級；MRS培養基、生理鹽水、孟加拉培養基，按標準方法配制。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；MK3超凈工作臺，上海日島科學儀器有限公司；FA2004B分析天平，上海精科科學儀器有限公司；KDC-40恒溫培養箱，科大創新股份有限公司中佳分公司；SHZ-88A立式高壓滅菌鍋，江蘇太倉市實驗設備廠；pHS-3C精密pH計，上海日島科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 奶啤制作工藝流程

奶啤制作工藝流程如下：

配制原乳液→分裝→酶水解→滅菌滅酶→冷卻→酶解液發酵→奶啤

配制原乳液：將脫脂奶粉、白砂糖、益生元、水以質量比10∶10∶1∶79溶解；酶水解：常溫下水解4 h；滅菌滅酶：85 ℃，20 min；共發酵：酶水解液接種德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌及安琪酵母，于30 ℃發酵15 h。

1.3.2 奶啤發酵工藝的確定

1.3.2.1 單因素試驗

按照1.3.1配制的原乳液，分別選用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶進行酶解，酶活分別為200、400、600、800、1 000 U/mL，常溫下水解4 h，于85 ℃滅菌滅酶20 min。向酶水解液中添加桿菌和球菌比例分別為10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10，添加酵母數量為105、106、107、108CFU/mL，30 ℃共發酵15 h，考察奶啤的感官評分及pH值、活菌數(酵母和乳酸菌數)[11-12]。

1.3.2.2 Box-Behnken試驗設計方案

參照段琳琳等[13]研究進行改進，篩選3個因子進行優化處理，在單因素實驗的基礎上設計響應面中心點，用Design Expert 8.0.6 Trial進行試驗設計和分析，具體如表1所示。

表1 采用 Box-Behnken 試驗設計因素水平及編碼Table 1 Variables and levels in response surface design

1.3.3 感官評定

采用感官鑒定評分法，由10位感官評價員分別對奶啤顏色、口感、組織形態、氣泡、氣味進行評價。評價標準及評分改進參照胡曼等[14]的研究。評分細則如表2所示。

1.3.4 數據處理

所有試驗均重復3次；采用系統軟件Design-Expert 8.0.6 Trial進行響應面分析；采用系統軟件SPSS進行顯著性分析，P<0.05認為差異顯著。

表2 奶啤感官評分標準Table 2 Sensory rating criteria of milk beer

2 結果與分析

2.1 不同酶種類對奶啤感官評分和發酵參數的影響

木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶及中性蛋白酶對奶啤感官評分和發酵參數影響如圖1所示。由圖1-A可知，3種蛋白酶的感官評分存在顯著性差異(P<0.05)。唐霄等[15]表明中性蛋白酶酶水解鵝肉蛋白產生的游離氨基酸類型豐富，酶解液風味好且鮮味濃郁。不同蛋白酶協同菌株發酵所得pH顯著不同(P<0.05)，其中菠蘿蛋白酶對應pH最低,木瓜蛋白酶對應pH最高。從圖1-B可以看出，中性蛋白酶酶解液對酵母和乳酸菌的生長均起到較好的促進作用；木瓜蛋白酶對乳酸菌生長效果最好，對酵母效果最差，但菠蘿蛋白酶作用效果與其相反。酶解所得的多肽和氨基酸可作為菌株的增殖因子，促進乳酸菌和酵母的增殖。李雪霞等[16]表明酪蛋白酶解產物可有效促進益生菌的生長。馬宇驥等[17]和邵志芳等[18]表明中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶對乳酪蛋白的水解度分別為(25.25±0.35)%、(6.83±0.05)%、(9.56±0.2)%。綜合考量感官評分和發酵參數指標，中性蛋白酶酶解液的發酵效果最好。

A-對pH值及感官評分的影響；B-對酵母菌數和球菌 與桿菌比例的影響圖1 不同酶種類對奶啤的影響Fig.1 The effects of different enzymes on milk beer

2.2 不同酶活對奶啤感官評分和發酵參數的影響

不同酶活性對奶啤感官評分和發酵參數影響如圖2所示。由圖2-A可知，隨著中性蛋白酶酶活性增強，感官評分升高，但當酶活>800 U/mL時，感官風味下降。CINDY等[19]表明蛋白質水解液中存在含脯氨酸等疏水性氨基酸殘基,而此類殘基刺激味蕾產生苦味，故過高酶活會影響奶啤風味。通過感官品嘗得知，向酶水解液中接入乳酸菌和酵母共發酵可降低苦味。劉萌等[20]表明酵母的脫苦效果優于乳酸菌,因為乳酸菌代謝肽酶屬于胞內酶,而釀酒酵母在細胞壁存在端肽酶，脫苦機理是乳酸菌先產生內切酶將完整蛋白分子水解成肽鏈, 酵母菌再產生端肽酶將疏水性氨基酸殘基切除。隨著酶活性增強，pH值呈先降低后上升的趨勢(圖2-A)。從圖2-B可知，隨著酶活性增強，酵母數量顯著增多(P<0.05)。楊泓喆[21]表明中性蛋白酶水解產生的肽和氨基酸，為酵母發酵提供足夠氮源。隨著酶活性增強，乳酸菌數增加，但酶活性為400、600、800 U/mL協同混合菌共發酵之間無顯著性差異(P>0.05)。綜合考量感官評分和發酵參數指標，最優酶活性為800 U/mL。

2.3 桿菌和球菌比例關系對奶啤感官評分和發酵參數的影響

接種德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌107CFU/mL，不同桿菌和球菌比例對感官評分和發酵參數影響如圖3所示。由圖3-A可知，桿菌和球菌比例為1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1時，各組感官評分無顯著性差異(P>0.05)。隨著球菌接種量提高，比例為2∶1和1∶5的兩組pH值較低。除2∶1和1∶10外的各組別，隨著比例降低，菌落數逐漸增多(圖3-B)。桿菌和球菌比例趨近于1∶1時，酵母菌落數增多，在比例為2∶1時達到最高。李變變[22]表明桿菌∶球菌為1∶1時, 兩菌共生效果較佳。綜合考量感官評分和發酵參數指標，桿菌∶球菌最優比例為2∶1。

A-對pH值及感官評分的影響；B-對酵母菌數和球菌 與桿菌比例的影響圖2 不同酶活性對奶啤的影響Fig.2 The effects of different enzyme activities on milk beer

A-對pH值及感官評分的影響；B-對酵母菌數和球菌 與桿菌比例的影響圖3 不同桿菌、球菌比例對奶啤的影響Fig.3 Influence of ratio of different Bacilli to Cocci on milk beer

2.4 不同酵母數量對奶啤感官評分和發酵參數的影響

不同酵母量對感官評分和發酵參數影響如圖4所示。由圖4-A可知，比較酵母數量為105、106、107CFU/mL組別，隨著酵母數量增加，感官評分增加，但組別之間差異不顯著(P>0.05)。當酵母數量為108CFU/mL，奶啤對應pH最高，而酵母數量為105、107CFU/mL 時pH較低。由圖4-B可知，隨著酵母數量增多，乳酸菌數顯著增多(P<0.05)，說明酵母菌與乳酸菌協同生長。VILJOEN[23]表明酵母菌為乳酸菌提供丙酮酸鹽、氨基酸和維生素等必需營養因子而促進乳酸菌生長。這與ROOSTITA等[24]和REYES-SNCHEZ等[25]結果不同，他們認為馬克斯克魯維酵母菌因分泌脂肪酶分解乳脂肪為游離脂肪酸而抑制乳酸乳球菌生長。當酵母數量達到108CFU/mL時，酵母死亡率大于出生率，原因可能是酵母數量過多，而糖含量有限，無法提供充足的營養物質，其次乙醇含量增多也會導致酵母生長率降低。NISARUT等[26]表明高濃度乙醇會抑制葡萄糖和氨基酸轉運，導致丙酮酸激酶和己糖激酶等關鍵糖酵解酶變性，并增加膜的通透性，使酵母喪失正常生理功能，但具體原因還有待研究。綜合考量感官評分和發酵參數指標，并考慮生產成本，最優酵母數量為107CFU/mL。

A-對pH值及感官評分的影響；B-對酵母菌數和球菌 與桿菌比例的影響圖4 不同酵母量對奶啤的影響Fig.4 Effects of different yeast contents on milk beer

2.5 響應面試驗

2.5.1 Box-Behnken 試驗結果

Box-Behnken設計與結果如表3所示，利用Design Expert 8.0 進行分析和多元回歸擬合，建立以感官評分為目標函數的二次回歸方程，并對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗。

2.5.2 方差分析

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface experimental design and results

表4方差分析顯示，該回歸模型顯著(P<0.05)，說明感官評分與各個變量之間存在顯著的線性相關，失擬性在置信區間95%水平上不顯著，即方程失擬度較小，可利用該模型預測響應值感官評分與變量之間的關系。

表4 回歸方程方差分析及顯著性檢驗Table 4 Test of significance for regression equation coefficients of sensory evaluation

回歸方程繪制等高線和響應面圖如圖5所示，酵母數量與桿菌和球菌比例交互作用顯著，與表4中交互相P值的分析結果一致。響應面的坡度較陡峭，表明感官品評的響應值對酵母數量與桿球之比的變化較為敏感。在酵母數量不變的條件下，隨著桿球菌比值的提高，響應值先逐漸升高再逐漸降低；在桿球菌比值不變的條件下，隨著酵母數量升高，響應值先逐漸升高再逐漸降低。

a-桿球菌比例與酶活性的交互；b-桿球菌與酵母數量的交互；c-酵母數量與酵母活性的交互圖5 任意兩變量對感官評分影響的響應曲面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of any two variables on sensory evaluation

經過響應面分析,并根據擬合二階模型公式得到理論上感官評分最大值為84.3，此時奶啤發酵工藝的最優理論條件為桿菌∶球菌值為1.7，酵母數量為5.3×107CFU/mL，酶活性為788 U/mL。考慮到實際操作的可行性，將上述最優條件修正為桿菌∶球菌為1.5，酵母數量為5.0×107CFU/mL，酶活力為800 U/mL，此時理論的感官評分為84.2。

2.5.3 最佳條件的驗證試驗

為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化奶啤生產工藝，進行3次平行試驗，結果測得感官評分為84.0，與預測值基本一致，說明通過上述實驗方法得到的最優發酵條件可靠，具有參考價值。同時測定最優生產工藝時其他理化指標，酵母數量為6.5×107CFU/mL，細菌數量為4.0×1011CFU/mL，pH值為4.74。

3 結論

實驗結果表明，以感官評分為響應值，經響應面優化奶啤的最佳發酵條件為桿菌與球菌比例為1.5∶1，酵母數量為1.0×107CFU/mL，酶活力為800 U/mL。在該發酵條件下，奶啤中酵母數量為6.5×107CFU/mL，細菌數量為4.0×1011CFU/mL，pH值為4.74。本試驗運用響應面優化方法可為工業發酵優化提供參考。