響應面優化羊肉負離子電場腌制工藝

樊沙娜，李斯琦，劉彥秋，白楊，都日瑪，莎日娜

(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特, 010018)

負離子電場(靜電場)是通過電板中填充高分子材料，當通電時分子之間相互碰撞、摩擦等物理作用，會使電板中產生巨大的能量，積累的能量導致電板中電位迅速增加而產生大量靜電運動。這些靜電運動的材料會向環境放電并將負電荷擴散到環境中，從而在一定空間范圍內長時間制造負離子的氛圍[1-5]。目前國內外研究負離子電場的應用主要集中在果蔬、肉類的保鮮方面。高壓靜電場處理可以減少鮮核桃青皮中總酚的損失，降低腐爛指數，延長保鮮期[6]；在高壓靜電場條件下解凍兔肉優于常規解凍，而且不會造成兔肉的脂質氧化[7]；可以最大限度延長冷凍生鮮食品保鮮期[8-10]。DENBA+靜電場處理有效地加快了豬肉的凍結速率，降低脂肪氧化速率和嫩度，減少冷藏豬肉菌落總數[11]等。將肉類置于負離子電場中腌制可利用負離子電場使分子運動加快、抑制微生物繁殖、降低脂肪氧化速率等作用，對傳統腌制技術的不足進行改善[12-13]。本試驗將腌制技術與負離子電場結合，用Box-Behnken設計與響應面法優化負離子電場腌制工藝，獲得腌制的最佳工藝，為負離子腌制技術降低腌制肉品脂肪氧化提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羊后腿肉，采樣于內蒙古錫林古勒盟蘇尼特羊繁育基地；食鹽，呼和浩特市家樂福超市；NaNO2、抗壞血酸(分析純)，天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

分析天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；GZX-9數顯鼓風干燥箱，上海一恒儀器有限公司；磁力攪拌器，常州易晨儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器責任有限公司；靜電磁場裝置，呼和浩特市綠碧電子設備有限公司；

1.3 方法

1.3.1 原料肉處理

將冷凍的蘇尼特羊后腿肉在4 ℃條件下隔夜解凍，解凍后的肉切成5 cm×5 cm×5 cm的肉塊，然后用注射器將混合好的腌制液注入肉塊中，將肉塊放在封閉的容器內腌制，腌制后進行測定。

試驗腌制液：每100 g優質羊后腿肉，用100 mL水分別溶解0.1 g NaNO2和1 g抗環血酸，試驗前將配制好的2種研制液放于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 腌制方法

新型負離子電場腌制：稱取250 g肉樣，通過注射器將25 mL NaNO2溶液和12.5 mL抗壞血酸混合溶液注入肉塊中，然后撒入6.25 g食鹽，在容器內用手揉捻、翻動數下，用封口膜封口進行腌制。為腌制均勻，每6 h上下翻動1次。

1.3.3 負離子電場對羊肉肌紅蛋白總量及相關色素的測定

取肉樣20 g，加入20 mL濃度為0.04 mol/L，pH 6.8的磷酸鈉緩沖劑,用快速攪拌器在室溫下均質20 s。然后將樣品于冰浴中冰浴1 h，取出于8 000 r/min、4 ℃下離心20 min。將上清液用濾紙過濾，用同樣的緩沖液加至刻度25 mL。使用TU-1810紫外可見風光光度計測定在525、545、565和572 nm 處的吸光率。肌紅蛋白總量及脫氧肌紅蛋白(deoxyMb)、氧合肌紅蛋白(MbO2)等及高鐵肌紅蛋(MetMb)各部分的比例按照孟宇竹等[14]方法，計算如公式(1)～公式(4)所示：

肌紅蛋白總量(mmol·L-1)=-0.166A572+0.086A565+0.088A545+0.099A525

(1)

脫氧肌紅蛋白/%=(0.369R1+1.140R2-0.941R3+0.015)×100

(2)

氧合肌紅蛋白/%=(0.882R1-1.267R2+0.809R3-0.361)×100

(3)

高鐵肌紅蛋白/%=(-2.541R1+0.777R2+0.800R3+1.098)×100

(4)

式中：Rl、R2、R3分別是吸光率比值A572/A525、A565/A525、A545/A525。

1.3.4 單因素試驗變量因素設定

在固定腌制劑加入量下，設置各因素水平為腌制溫度(0、2、4、6、8 ℃)、腌制場強(0、1、3、5、7 kV)、腌制時間(10、11、12、13、14 h)對腌肉肌紅蛋白相關量的影響。

1.3.5 響應面試驗

依據Box -Behnken中心設計原理，結合負離子電場腌制工藝，選擇場強、腌制溫度和腌制時間3個因素為自變量，以腌制肉的氧合肌紅蛋白含量的結果為響應值，設計3因素3水平試驗，見表1。所有測定試驗重復3次，實驗結果取平均值。

1.4 數據分析

所有試驗處理重復3次取平均值，數據采用SPSS 18.0和Excel進行分析，采用Box-Behnken法進行差異顯著性分析，P<0.05。應用Origin 8.0軟件作圖。

表1 Box-Behnken設計因素水平表Table 1 Variables and levels used in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 腌制溫度對腌肉中肌紅蛋白相關色素的影響

不同腌制溫度對腌肉中肌紅蛋白相關色素的影響如圖1所示。

圖1 腌制溫度對腌肉中肌紅蛋白相關色素的影響Fig.1 Effect of different pickling temperature on myoglobin related pigment in cured meat

肉制品的顏色是評價肉的重要指標，肉制品的顏色主要由肉中的脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白含量決定，在一定范圍內氧合肌紅蛋白含量越高肉的色澤越鮮紅，相反高鐵肌紅蛋白含量越低肉的色澤越鮮紅[15-16]。由圖1可知，氧合肌紅蛋白含量隨著溫度的升高先增加后減小，在4 ℃時達到最大值，高鐵肌紅蛋白含量隨著腌制溫度呈減小趨勢；相反，脫氧肌紅蛋白的含量隨著腌制溫度的升高呈增加趨勢。綜合比較腌制后6 ℃時肉的顏色與新鮮原料肉的顏色最接近，所以將6 ℃確定為腌制效果最佳溫度。因此選擇腌制溫度4、6、8 ℃進行響應面實驗。

2.1.2 腌制時間對腌肉中肌紅蛋白相關色素的影響

不同腌制時間對腌肉中肌紅蛋白相關色素的影響如圖2所示。

圖2 腌制時間對腌肉中肌紅蛋白相關色素的影響Fig.2 Effect of different pickling time on myoglobin related pigment in cured meat

隨著腌制時間的延長氧合肌紅蛋白含量和脫氧肌紅蛋白含量整體呈先增加后減小的趨勢；氧合肌紅蛋白含量增加是因為肉在腌制過程中，肌紅蛋白和亞硝酸鹽發生一系列的反應生成亞硝基肌紅蛋白，使肉呈鮮紅色其含量增加；在11～12 h時，氧合肌紅蛋白含量減小而脫氧肌紅蛋白增加，這是因為密閉容器內的氧分逐漸減少，使氧合肌紅蛋白脫氧轉化為脫氧肌紅蛋白[17]；相反，高鐵肌紅蛋白的含量呈先減小后增加的趨勢，在12 h達到最小值之后逐漸增大，其原因是腌制過程亞硝基肌紅蛋白并不穩定，較長的腌制時間導致其被逐漸氧化成高鐵肌紅蛋白，使肉的表面逐漸變暗[18]。綜合比較3種肌紅蛋白相關量的趨勢，在腌制時間為12 h時，氧合肌紅蛋白含量最較高，腌制效果最好。因此選擇腌制時間11、12、13 h進行響應面實驗。

2.1.3 負離子場強對腌肉中肌紅蛋白相關色素的影響

不同場強對腌肉中肌紅蛋白相關色素的影響如圖3所示。

圖3 不同場強對腌肉肌紅蛋白相關色素的影響Fig.3 Effect of different field strength on the amount of marinade myoglobin

由圖3可知，在負離子電場腌制條件下，脫氧肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白的含量隨著場強的增加先增加后減小，在3 kV時達到最大值，分別為34.328%、18.075%；高鐵肌紅蛋白含量隨著負離子電場強度的增加而呈先減小后增加趨勢，在3 kV時達到最小，脫氧肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白含量在3 kV后降低原因是過高的場強處理后加快氧合肌紅蛋白氧化成高鐵肌紅蛋白[19]。另外，亞鐵血紅素被代替或分離造成球蛋白分子部分變性，鐵原子的釋放使卟啉環被修飾(鐵原子的釋放可以促進其氧化，而且與球蛋白的變性有關) 等都能造成肌肉顏色的改變[20]。綜合比較，場強為3 kV時，鮮紅色的氧合肌紅蛋白含量最高，且最不理想的褐色高鐵肌紅蛋白含量最低，所以選擇場強為1、3、5 kV進行響應面試驗。

2.2 負離子電場腌制響應面法優化分析

2.2.1 響應面法試驗結果分析

根據Box-Behnken中心設計原理，在單因素試驗的基礎上，選取影響較大的因素，以腌制場強(A)、腌制時間(B)、腌制溫度(C)為自變量，以腌制后氧合肌紅蛋白作為響應值設計響應面實驗(表2)。

通過軟件Design-Expert分析，得到的關于負離子電場腌制對羊肉氧合肌紅蛋白的回歸方程如下：

Y=20.35+0.29A+0.18B+0.089C+0.055AB-2.500E-003AC-0.27BC-1.03A2-0.014B2+0.069C2

式中：A、B、C分別代表腌制場強、腌制時間和腌制溫度。通過Design-Expert分析，驗證回歸模型及各參數的顯著度、失擬項結果見表3。

表2 響應面試驗設計和結果Table 2 The design and results of response surface experiment

由表3響應面的結果可知，模型的P=0.000 2(<0.01)，表明回歸模型達非常顯著水平，回歸方程失擬項P=0.380 3(>0.05)，失擬值差異不顯著，說明所選模型成立。回歸模型中一次項A、B、交互項BC和二次項A2影響極顯著。復相關系數R2為98.97%，說明模型相關度很好，實驗誤差小。

表3 響應面方差分析表Table 3 Analysis of variance table of regression equation

2.2.2 因素間的交互作用

經Design-Expert軟件所得的響應面曲線圖，如圖4～圖6所示。等高線可以直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著[21]。

圖4 場強與腌制時間對氧合肌紅蛋白含量 交互作用影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface and contour of the interaction between field strength and curing time on the content of oxygenated myoglobin

由圖4可知，場強與腌制時間對氧合肌紅蛋白含量交互作用顯著。當腌制時間不變時，隨著負離子電場強度的增加，氧合肌紅蛋白含量呈先增加后減小的趨勢，因此，合適的場強有利于保持肉的顏色。

圖5 場強與腌制溫度對氧合肌紅蛋白含量 交互作用影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface and contour of the interaction between field strength and curing temperature on the content of oxygenated myoglobint

由圖5可知，腌制溫度與場強對氧合肌紅蛋白的交互作用不顯著，當腌制溫度不變時，隨著場強的增大氧合肌紅蛋白的含量呈先增加后減小的趨勢。

圖6 腌制時間與腌制溫度對氧合肌紅蛋白含量 交互作用影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour of the interaction between curing time and curing temperature on oxygenated myoglobin content

由圖6可知，腌制時間與腌制溫度間對氧合肌紅蛋白的交互作用極顯著，隨著腌制時間的增大及腌制溫度的提高，氧合肌紅蛋白的含量呈逐漸增加趨勢。只有場強、腌制時間及腌制溫度適宜，氧合肌紅蛋白的含量最佳，腌肉的顏色達到最理想。

2.2.3 工藝優化及驗證試驗

通過Design Expert分析優化，得到負離子電場腌制的最優工藝為場強3.34 kV，腌制時間13 h，腌制溫度4 ℃，氧合肌紅蛋白含量為20.79%。考慮到實際條件的局限性，將最優工藝參數稍作調整為腌制場強3 kV、腌制時間13 h、腌制溫度4 ℃。利用更改后的工藝參數進行腌制，相同條件下重復試驗3次，得到的氧合肌紅蛋白含量數據平均值為(20.67±0.18)%。與預測值20.79%基本相符，說明模型可以較好地預測負離子電場腌制后羊肉中氧合肌紅蛋白含量變化情況，具有實際參考價值。

3 結論

負離子電場腌制可以防止羊肉脂肪氧化，有效地保持肉的顏色。在腌制過程中，場強強度和腌制時間對羊肉氧合肌紅蛋白含量有顯著影響。根據Design Expert分析結果和實驗得出最佳工藝條件為腌制場強3 kV、腌制時間13 h、腌制溫度4 ℃，在此條件下羊肉的氧合肌紅蛋白含量為20.67%，與預測值吻合。因此，優化得到的負離子電場腌制工藝參數準確可靠，具有實際意義和參考價值。