微生物甲硫氨酸合成調控的綜合研究進展與展望

趙嫚，彭莉，成浩，應向賢，汪釗

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州, 310014)

甲硫氨酸(methionine，Met)，包括L-甲硫氨酸和D-甲硫氨酸兩種構型，L-甲硫氨酸是人和動物必需的含硫氨基酸，在生物體內具有重要的生理生化功能。具體功能包括參與DNA、蛋白質的合成和蛋白結構的穩定；是精胺、亞精胺和乙烯等的前體，參與細胞分裂分化、凋亡、穩態和基因表達等生物生長發育的各個方面；并通過其主要代謝產物S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)間接調節各種代謝過程，為脂類、蛋白質、核酸、生物堿類和植物固醇等多種化合物提供甲基[1]。近年來，Met的需求量大幅度增加，預計2022年全球市場份額可達73億美元，其中飼料添加劑是最大的消費市場。此外，Met在食品添加劑、醫藥和化妝品等領域的需求也呈長期穩定增長趨勢[2-5]。

Met的合成主要包括化學法、酶法和微生物發酵法3種，目前工業上主要采用化學法和化學-酶法。盡管化學法和酶法技術成熟、成本低，但微生物發酵法因其綠色、高效和周期短等優勢，受到研究者的廣泛關注。Met發酵法合成的研究主要集中在大腸桿菌(Escherichiacoli)和谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)中，目前已經報道的E.coli和C.glutamicum中Met的最高產量分別約為30 g/L和9.88 g/L[6-15]，如表1所示，該水平距離工業化應用還存在一定的差距。隨著Met市場需求的逐年增加，對提高Met產量的研究迫在眉睫。代謝物產量的高低與代謝合成過程中關鍵基因的相互調控密不可分。本文將對近幾年Met的合成過程、調控機制和環境因素的研究進展進行全面綜述，以期為Met合成產量的提高提供基礎。

表1 甲硫氨酸產生菌構建的典型實例Table 1 Representative examples of the methionine producing strains

1 Met的生物合成

Met能夠在大多數的植物和微生物中合成，其合成途徑已經被完全解析，主要涉及兩個部分，即從頭合成途徑-天冬氨酸合成途徑和硫同化過程(圖1)[16-17]。

1.1 從頭合成途徑

除Met以外，必需氨基酸異亮氨酸、賴氨酸和蘇氨酸也是由該途徑的不同分支產生(圖1)。以C.glutamicum中從頭合成途徑為例，Met合成的具體過程是天冬氨酸在天冬氨酸激酶(Aspartate kinase, lysC)的催化下形成天冬氨酰-4-磷酸，然后被天冬氨酸半醛脫氫酶(Aspartaldehyde dehydrogenase, asd)催化形成天冬氨酸-4-半醛，后者被高絲氨酸脫氫酶(Homoserine dehydrogenase, hom)氧化成高絲氨酸；高絲氨酸在高絲氨酸-O-乙酰基轉移酶(Homoserine acetyltransderase, metX)的作用下生成O-乙酰-L-高絲氨酸，然后再依次在胱硫醚γ合成酶(Cystathinine γ-synthase, metB)和胱硫醚β裂解酶的作用下分別形成胱硫醚和高半胱氨酸，最后高半胱氨酸在甲硫氨酸合成酶(Methionine synthase, metEH)的作用下，以四氫葉酸(CH3-THF)作為甲基供體合成Met。此外，在C.glutamicum中O-乙酰-L-高絲氨酸還可以在O-乙酰-L-高絲氨酸硫化酶(O-acetylhomoserine sulfhydrylase, metY)的作用下直接合成高半胱氨酸，進而合成Met。

在不同的生物中，合成途徑存在一定的差異(圖1, 表2)，如高絲氨酸在C.glutamicum中經過高絲氨酸乙酰轉移酶(Homoserine acetyltransferase, HAT)催化形成O-乙酰-L-高絲氨酸，而在E.coli和植物中則分別被高絲氨酸-O-琥珀酰基轉移酶(Homoserine succinyltransderase, metA)和高絲氨酸激酶(Homoserine kinase, HK)催化形成O-琥珀酰-L-高絲氨酸和O-磷酸-L-高絲氨酸[18]。在古細菌中，天冬氨酸-4-半醛可以在硫化酶的作用下，直接合成高半胱氨酸[17]。

1.2 硫同化

圖1 甲硫氨酸生物合成途徑與調控Fig.1 Biosynthesis pathway and regulation of Methionine

從頭合成途徑中天冬氨酸直接合成Met需要1個ATP和2個NADPH，無機硫的同化則需要2個ATP和4個NADPH。因此Met的合成除了受到從頭合成途徑和硫同化內部途徑關鍵酶等合成過程的調控外，還受到能量、輔因子和外界環境等多種不同層次的綜合調控。

2 Met合成過程的調控

2.1 Met合成關鍵酶的調控

甲硫氨酸的合成受到多個關鍵酶的調控。首先，天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)是Met合成途徑的第一個限速酶，催化ATP依賴的天冬氨酸磷酸化形成天冬氨酰-4-磷酸。在E.coli中AK由thrA、metL和lysC三個基因編碼，這些基因的表達分別受蘇氨酸、Met和賴氨酸的反饋阻遏調節[21]。而在C.glutamicum中AK僅有一個編碼基因lysC，其表達同時受到蘇氨酸和賴氨酸的反饋阻遏[22]。過表達lysC以及不受賴氨酸反饋抑制的突變體可使最終產物的含量顯著提高。此外，在酶活水平上，AK還受其終端產物反饋抑制調節。在C.glutamicum中，對基因lysC進行定點突變為A279T和G359D，結果表明，lysC的突變可部分解除AK的活性受蘇氨酸和賴氨酸的反饋阻遏抑制[21,23]。高絲氨酸脫氫酶是天冬氨酸合成途徑的關鍵雙功能酶，包含天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶兩個功能。在E.coli中，高絲氨酸脫氫酶是由thrA和metL兩個基因進行編碼。thrA的轉錄受到蘇氨酸和異亮氨酸的抑制，具體原因是thrA、thrB(在蘇氨酸合成途徑中編碼高絲氨酸激酶)和thrC(編碼蘇氨酸合成酶)在染色體上組成thrABC操縱子，蘇氨酸和異亮氨酸通過與該操縱子上游的一段前導序列作用，反饋抑制基因的表達；而metL僅受到Met的反饋抑制。而在C.glutamicum中hom受到蘇氨酸的抑制，且其G378S定點突變可部分解除hom的活性受蘇氨酸和賴氨酸的反饋阻遏抑制[24-25]。在Met的合成過程中，除了Met以外，其下游產物S-腺苷甲硫氨酸(S- adenosylmethionine, SAM)也參與到Met的合成調控，比如metA和metB均受到SAM的反饋抑制，進而影響Met的合成。

表2 L-甲硫氨酸生物合成相關的酶及其編碼基因Table 2 Enzymes and their encoding genes related to the methionine synthesis

在E.coli中，metA、metB和metC位于一個操縱子上，高效表達該操縱子基因是提高Met常用的策略。USUDA等[26]在E.coliW3110 中過表達metA，使Met的含量從0.13 g/L提高到0.24 g/L。郭謙等[27]在一株經過紫外誘變篩選選育出的Met高產菌株E.coliYB12的基礎上，過表達metA、cysE(絲氨酸合成半胱氨酸途徑中絲氨酸乙酰轉移酶編碼基因)和編碼Met轉運蛋白的yeaS基因，使E.coliYB12中Met的含量從60 mg/L提高到251 mg/L。另外，在1株生產賴氨酸的C.glutamicum菌株中，對metX和metY基因過表達導致Met的產量提高到16 g/L[28]。因此，Met合成途徑的這些關鍵酶是調控其代謝途徑的關鍵限速酶。WEI等[29]在提高Met重要中間體O-乙酰高絲氨酸的研究中，基于蛋白質工程的進化保守分析和結構指導的工程化提高了關鍵酶高絲氨酸乙酰轉移酶(Homoserine acetyltransferase， metXlm)的活性且減少反饋抑制，使酶的活性增加了12.5倍，并通過守恒優化，最終使產物O-乙酰高絲氨酸產量增加57.14%[29]。

2.2 Met合成競爭途徑的阻斷

天冬氨酸合成途徑中的賴氨酸和蘇氨酸合成途徑是Met合成的2個關鍵競爭途徑，分別通過天冬氨酸-4-半醛和高絲氨酸實現競爭。研究發現，2個競爭途徑的去除會為Met的合成提供更多的天冬氨酸-4-半醛和高絲氨酸底物，從而有效提高Met的產量。研究中常用的是賴氨酸合成途徑中dapA(在賴氨酸合成途徑編碼二氫二吡啶甲酸合酶)和蘇氨酸合成途徑中thrB的敲除[16]。例如，在C.glutamicum13032中通過thrB的敲除和賴氨酸合成途徑的減弱(dapA中用稀有密碼子GTG代替起始密碼子ATG)，Met的產量從0.89 g/L提高到2.99 g/L，增加了3倍[7]。在E.coliW3110中，通過thrBC的敲除獲得蘇氨酸營養不良菌株，與野生型相比，其Met產量從無法檢測提高到0.008 g/L[26]。吳婷婷[30]在E.coliK-12/pKD46菌株中敲除dapA基因后，其Met的含量提高了2.61倍。

2.3 Met轉錄調節子的轉錄調控

Met合成的轉錄調控除了限速酶的表達受到產物的反饋抑制外，還包括各種調控蛋白的調控[31]，如MetJ和MetR。MetJ是Met合成的關鍵阻遏蛋白，在E.coli中阻遏metL、metA、metB、metC和metE基因的表達[32]。研究發現，將MetJ第54位的Ser替換為Asn，可以消除其反饋阻遏作用，提高Met的產量[33]。與E.coli相對應的，在C.glutamicum中Met的合成和攝入則是由McbR阻遏蛋白調控。McbR是C.glutamicum硫代謝的全局調控因子，涉及的基因包括hom、metX、metB、metE和metH等[34]。很多研究已經表明，通過對細菌metJ或mcbR基因的敲除或修飾，可解除其對細胞生產Met能力的禁錮，使菌株產生更多的Met[6,9,26-27,35]。與MetJ相反，MetR是一類轉錄激活因子，過表達后可大大促進Met的合成，前期研究，通過共表達metE和metR的研究發現，MetR是metE基因表達的反式激活因子，然而在MetJ蛋白和SAM的存在下，metR基因的表達被抑制[36]。

2.4 Met轉運體的調控

菌株經過一系列代謝工程改造后，胞內氨基酸的積累會抑制其合成途徑關鍵酶的催化活性，增加其降解途徑的前體可利用性，甚至抑制細胞生長。因此，Met的轉運也成為其生產的限速步驟[31,37]。在E.coli中，過表達Met輸出蛋白YjeH、YeaS和敲除Met攝入蛋白MetD、MetP均顯著增加了Met的積累[38-39]。在基因工程菌C．glutamicum中敲除Met的攝取蛋白MetQP或過表達輸出蛋白BrnFE或MetT，Met的含量都顯著提高[40-41]。

3 硫同化對Met合成的調控

4 NADPH對Met合成的影響

Met的合成從硫同化到從頭合成途徑共需要6個NADPH和3個ATP。因此能量和還原力的提高是保證Met高效合成的關鍵。NADPH在C.glutamicum和E.coli中分別是以不同的方式進行提供。在C.glutamicum中，NADPH主要是通過戊糖磷酸途徑中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH, zwf)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH, gnd)，而在E.coli中主要是通過膜結合的轉氫酶合成[48-49]。此外，前人的研究已經嘗試了不同策略來增加NADPH的供應，最常用的是調整糖酵解途徑和戊糖磷酸途徑之間的代謝流量比。C.glutamicum戊糖磷酸途徑中的zwf和gnd進行突變以消除其反饋抑制，構建了zwfA243T和gndS361F突變體后，氨基酸的產量呈現了不同程度的增加[50]。此外，通過過表達果糖-1,6-二磷酸酶基因(fbp)，加速碳源從糖酵解轉向戊糖磷酸途徑，也顯著增加了還原力的提供[49,51]。此外，BOMMAREDDY等[52]不依賴于戊糖磷酸途徑的想法，僅通過改變天然NAD+依賴的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gapA)的輔酶專一性來生成NADP+，在提高甘油醛-3-磷酸脫氫酶對NADP+的催化效率的同時，所有受試突變體的氨基酸產量都得到了顯著提高(60%)。因此，糖酵解、戊糖磷酸途徑和三羧酸循環等初級代謝途徑中能量和輔助因子的通量變化通常會直接影響氨基酸的生物合成，因此，它們為生物工程轉化提供了一個潛在的目標，包括與能量和還原力形成相關的反應。

5 環境營養元素對Met合成的影響

5.1 營養元素對Met合成的影響

碳源是微生物生長的物質基礎。在工業氨基酸發酵中，葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油和蔗糖是目前最常使用的碳源，其濃度過高或過低均會影響Met的合成。比如，劉俊琦等[53]向培養基中添加高濃度的葡萄糖，導致菌體濃度和Met產量都有所下降。進一步的研究發現，不同的菌株對不同碳源的利用具有顯著的順序作用，如酵母菌、E.coli和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)順序利用較為明顯，而C.glutamcum很少表現出對底物碳源的共利用[54]。可見碳源的種類和比例對Met的產量有明顯的影響，因此可通過合適的碳源配比來提高Met生產水平。

氮源也是微生物生長的必需營養要素，為生物體合成蛋白質、核酸及其他含氮化合物提供原料。牛肉膏、蛋白胨及尿素是微生物常利用的氮源。不同的氮源對Met產量和菌體濃度均有影響，和其他氮素相比較，尿素的效果最好，適宜的尿素濃度對Met的產量至關重要[53]。

無機鹽是維持細胞穩態的重要因子，在Met的合成中不僅提供必需的環境和營養成分，而且還可以合成Met螯合物。Met螯合物因其具有較高的生物價值，增加牲畜的免疫力，現被廣泛用于飼料生產[55]，如甲硫氨酸硒[56]、甲硫氨酸銅[57-59]、甲硫氨酸鋅[60]和甲硫氨酸酪[61]。此外，在培養基中添加半胱氨酸乙硫氨酸等化合物均可使Met的產量顯著調高，如KUMAR等[62]在培養基中添加半胱氨酸，可使Met產量從2.34 g/L提高到3.39 g/L。金利群等[63]的研究發現通過控制發酵培養基中Na2S2O3的添加量，可顯著提高Met的產量；當Na2S2O3的添加量在3 g/L時，Met產量可提高41.3%。

5.2 培養條件對Met合成的影響

在發酵過程中，除了合理的營養元素外，培養條件也是影響Met產量的關鍵，包括pH、溫度及攪拌速率等。在微生物合成Met的過程中，pH值會直接影響代謝途徑中酶的活性。ZHOU等[13]研究發現，pH值為7時，E.coli發酵生產Met產量達到最高，分別比pH值6.5和7.5時提高37.78%和18.10%，表明中性pH值有助于E.coli發酵生產Met。溫度影響微生物發酵生長主要涉及兩個方面即影響菌體自身生長活力、誘導溫度影響代謝途徑蛋白質表達水平和相應酶活性[64]。有研究指出，用E.coli作為生產菌株生產Met最適宜溫度是28 ℃，此時參與Met生物合成的關鍵酶活性增強，Met產量為1.24 g/L，較33 ℃和25 ℃時高1.09倍和2.21倍。攪拌速率是影響細胞生長和代謝產物生物合成的重要因素。攪拌速度在200～400 r/min最為適宜，當攪拌速率為300 r/min時Met的產量最高[13]。

6 總結和展望

Met具有重要的工業價值。近幾年，隨著發酵工程、代謝工程和合成生物學的不斷發展和應用，研究者們利用基因工程菌生產Met已經成為Met開發的戰略方向，但是基于目前的研究進展，距離工業化生產仍然有待研究。Met合成途徑已經被完全解析，合成途徑的代謝調控尤其是從頭合成途徑的調控多數已經被揭示，但是在前體物質H2S和天冬氨酸，以及輔因子NADPH和ATP的提供等方面的調控也是限制Met合成的關鍵因素，還需要進一步探究。本課題組致力于微生物高產Met的探究，前期的研究發現對各個前體物質合成綜合調控的解析和工程化，是提高Met產量的關鍵。