一例牛源致病型大腸桿菌的分離鑒定

劉雪松，朱慶賀，楊旭東，張 艷，陳 曦，王 爽，王觀悅，穆永才，羅天瑤，史同瑞

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)俗稱大腸桿菌，屬于腸桿菌科、埃希氏菌屬，一種兼性厭氧、兩端鈍圓、革蘭氏陰性短桿菌，幾乎是所有動物腸道內(nèi)的常在菌。但隨著研究的不斷加深，發(fā)現(xiàn)了一些大腸桿菌是有致病性的[1]，可引起多種動物疾病。致病性大腸桿菌可以引起犢牛腹瀉，這種病發(fā)病急且具有傳染性，2～3日齡犢牛最易感染。本病又被稱為牛白痢，一般在氣溫多變的冬末春初發(fā)病率較高[2]。致病性大腸桿菌攜帶的毒力因子種類較多，其致病性也來源于多種毒力因子的相互作用。目前確定致病性大腸桿菌毒力因子主要有黏菌素菌毛、腸毒素、LEE毒力島、志賀毒素以及溶血素等。不同種致病性大腸桿菌所攜帶的毒力基因是不同的，因此可以通過PCR技術(shù)對致病性大腸桿菌進行分類。根據(jù)相關(guān)研究表明，產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)目前是導(dǎo)致犢牛腹瀉最常見的致病性大腸桿菌。目前牛源性致病性大腸桿菌所攜帶的毒力基因包括K88、K99、F17以及F41等[3-4]。

2018年11月黑龍江省哈爾濱市某牛場犢牛出現(xiàn)腹瀉癥狀。患病犢牛出現(xiàn)暴發(fā)性腹瀉，已導(dǎo)致3頭犢牛死亡。本試驗從該牛場送檢病死犢牛器官中分離細菌，并通過生化試驗、16S rRNA基因序列測定、毒力基因測定等方法對該株細菌進行鑒定，通過藥敏試驗篩選出這株細菌的敏感藥物，旨在為幫助該牛場治療犢牛腹瀉提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 無菌采集來自哈爾濱周邊地區(qū)某牛場中死亡犢牛的病料，包括小腸、大腸、瘤胃、肝臟以及脾臟等。

1.1.2 試劑與儀器 伊紅美藍培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。MH培養(yǎng)基，廣州鴻泉生物科技有限公司生產(chǎn)。50×TAE，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。革蘭氏染色液，鄭州理利生物工程有限公司生產(chǎn)。藥敏紙片、生化試驗管，杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。Taq Master Mix、DNA Marker，大連Takara公司生產(chǎn)。DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)。Bio-Rad梯度PCR儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)。凝膠圖像處理系統(tǒng)，青島科易偉業(yè)生物有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗動物 清潔級昆明雌鼠10只，40日齡，體重大致在22～25 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養(yǎng) 分別無菌取病死犢牛的小腸、大腸、瘤胃、肝臟以及脾臟接種于麥康凱和伊紅美蘭瓊脂平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，再挑取菌落形態(tài)特征明顯的單菌落，劃線傳代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3代后挑取單菌落進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細菌形態(tài)。

1.2.2 生化試驗鑒定 對分離出來的菌株進行相關(guān)生化試驗，包括麥芽糖、甘露糖、VP、吲哚、尿素酶、乳糖、L鼠李糖、間肌醇以及葡萄糖。

1.2.3 分離菌株的PCR擴增和測序 根據(jù)相關(guān)文獻[5]，合成大腸桿菌16S rRNA的通用引物。菌液為模板提取DNA，用細菌16S rRNA的通用引物，進行PCR擴增。引物序列如表1所示。

表1 16S rRNA通用引物序列Tab 1 16S rRNA universal primer sequence

1.2.4 毒力基因的測定 根據(jù)相關(guān)參考文獻中的引物序列設(shè)計CS31A、K88、K99、F17以及F41等毒力基因引物[6-7]。已提取的細菌DNA為模板進行擴增。引物序列如表2所示。

表2 毒力基因引物序列Tab 2 Primer sequence of virulence genes

1.2.5 動物致病性試驗 試驗小鼠分為試驗組和對照組，每組5只。試驗小鼠在試驗前適應(yīng)環(huán)境一周。在試驗前24 h禁食、禁水。根據(jù)相關(guān)文獻[3]，將分離菌種進行培養(yǎng)，并對試驗組小鼠進行腹腔注射。每只小鼠注射量為1.5×109CFU/只。對照組注射無菌生理鹽水。

1.2.6 藥敏試驗 按照CLSI相關(guān)指導(dǎo)[8]進行藥敏試驗。將分離得到的菌株用MH肉湯進行培養(yǎng)，用麥氏比濁儀將細菌濃度調(diào)整到0.5麥氏單位。將調(diào)整好的菌液均勻涂抹于MH瓊脂平板上。將藥敏紙片均勻的放置在涂抹細菌的平板上，兩紙片之間圓心的距離不少于24 mm，每個平板放置不超過5個紙片。質(zhì)控菌株為ATCC25922。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與形態(tài)觀察 分離出來的細菌在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)粉紅色菌落。在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)黑色帶金屬光澤、邊緣整齊、光滑濕潤的菌落。挑取菌落進行革蘭氏染色，通過鏡檢觀察到陰性桿菌，多散在，兩端稍鈍圓(圖1)。

圖1 分離菌株鏡檢(10×100)Fig 1 Morphology of isolates in the microscope(10×100)

2.2 生化鑒定 生化鑒定結(jié)果如表3所示。分離出的細菌能發(fā)酵乳糖，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵麥芽糖、甘露醇。吲哚試驗、鼠李糖試驗為陽性，VP、尿素酶以及間肌醇試驗為陰性。分離細菌的生化特性與大腸桿菌生化特性相一致。

表3 生化試驗結(jié)果Tab 3 Results of biochemical test

2.3 PCR鑒定 分離菌株通過DNA提取試劑盒，提取出DNA模板。提取的DNA模板經(jīng)合成16S rRNA通用引物進行擴增，凝膠電泳后，在1543 bp處獲得明顯的條帶(圖2)，復(fù)合預(yù)期大小。用膠回收試劑盒進行回收測序后，用NCBI的Blast功能進行比對，發(fā)現(xiàn)其與GenBank上已知的大腸桿菌16S rRNA序列同源性為98%～99%。結(jié)合生化試驗與序列比對結(jié)果，確定該株分離菌株為大腸桿菌。

2.4 毒力基因鑒定 以分離出的細菌的DNA為模板，檢測該株細菌是否具有K88、K99、F17、F41以及CS31A毒力基因。經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，該株細菌攜帶K99毒力基因，未檢測到其他毒力基因，如圖3所示，為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)。

2.5 動物致病性試驗 腹腔注射菌液的小鼠在注射完的6 h后，出現(xiàn)精神沉郁、顫栗等癥狀；8 h后，小鼠排稀便；24 h，小鼠全部死亡。對死亡小鼠進行剖檢，發(fā)現(xiàn)小鼠腹水增多，胃擴張鼓氣，腸道積液，腸系膜充血，病變情況如圖4所示。無菌采集病死小鼠的器官接種于麥康凱以及伊紅美藍培養(yǎng)基上。發(fā)現(xiàn)分別長出了粉紅色菌落和帶有金屬光澤的菌落。可以認為是腹腔注射的大腸桿菌導(dǎo)致了小鼠的死亡。對照組小鼠注射了生理鹽水，身體狀況良好，無死亡現(xiàn)象。

圖4 小鼠病變情況Fig 4 Pathological changes in mice

2.6 藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果如表4所示。將藥敏試驗結(jié)果與CLSI相關(guān)文件[10]進行對比，發(fā)現(xiàn)這株大腸桿菌對氨芐西林、頭孢曲松以及頭孢噻肟敏感，對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、左氧氟沙星以及四環(huán)素耐藥，對慶大霉素和土霉素素處于中介狀態(tài)。

表4 藥敏試驗結(jié)果Tab 4 Results of drug sensitivity

3 討論與結(jié)論

引起犢牛腹瀉的因素有很多，根據(jù)其發(fā)生的原因不同，大致可以分為消化不良性腹瀉以及傳染性腹瀉。傳染性腹瀉包括細菌、病毒以及寄生蟲性腹瀉[9]。細菌性犢牛腹瀉的病原菌很多，包括了大腸桿菌、沙門氏菌以及產(chǎn)氣莢膜梭菌等[10]。通過大量的試驗證明，在細菌性的腹瀉病中，致病性大腸桿菌引起的腹瀉病居多[11]，給相關(guān)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大影響。根據(jù)毒力因子、致病機理以及流行病學(xué)特征可以將致病性大腸桿菌分為五類，為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)以及腸粘附性大腸桿菌(EAEC)[12]。目前主要應(yīng)用PCR技術(shù)對相關(guān)毒力基因進行檢測，來對大腸桿菌進行分型。其中ETEC主要檢測的毒力基因為K88、K99、F17及F41等，EPEC為bfpA基因，EHEC主要檢測eaeA以及irp2基因[13-15]。通過檢測致病性大腸桿菌所攜帶的毒力基因，可以迅速為大腸桿菌進行分型，了解其致病機理以及對其治療方案提供科學(xué)依據(jù)。張震等研究發(fā)現(xiàn)，在黑龍江部分牛場致病性大腸桿菌毒力因子的調(diào)查與分析中，ETEC菌株的檢出率占比為76.09%[6]。經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查已經(jīng)證明，ETEC是導(dǎo)致犢牛腹瀉最常見的大腸桿菌，其致病性與毒力因子密切相關(guān)，其中就包括了黏附素性菌毛以及腸毒素。ETEC被證實在進入機體后會依靠菌毛定殖于小腸黏膜進行繁殖，并分泌腸毒素，干擾正常的代謝，引起腹瀉等癥狀，嚴重者可造成死亡[16]。菌毛K99最早分離于腹瀉的犢牛和羔羊，是ETEC常見的菌毛之一[17]。本次從病死犢牛的體內(nèi)檢出的致病性大腸桿菌攜帶的毒力基因為K99，屬產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)。本次試驗對分離出來的致病性大腸桿菌進行了分型，了解該株細菌的大體致病機理，為今后的治療提供了一定的理論依據(jù)。

藥敏試驗可以為治療某種病原菌造成疾病的臨床用藥提供依據(jù)。藥敏試驗結(jié)果顯示，本次分離出來的致病性大腸桿菌對氨芐西林、頭孢曲松以及頭孢噻肟敏感，對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星以及四環(huán)素展現(xiàn)出了耐藥性，這可能與這些抗生素多年來的使用有關(guān)系。根據(jù)王宏、楊斯琴等對牛源致病性大腸桿菌耐藥情況的研究[18-19]可以看出，細菌的耐藥性問題逐漸呈現(xiàn)出來，多重耐藥的情況逐漸加重。研究表明，牛源致病性大腸桿菌對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、多西環(huán)素等抗生素展現(xiàn)出較為強烈的耐藥性，一些菌株多重耐藥性情況嚴重，少則為4重耐藥，多則達到17重耐藥[20]，這對以后具有多重耐藥性細菌的治療會帶來許多阻礙。面對這種情況，許多專家提出了解決方案，如抗生素的輪流使用、聯(lián)合用藥以及通過PK/PD模型對藥物的劑量以及給藥間隔重新進行評定[21]等，其中通過PK/PD模型對現(xiàn)有以及正在研發(fā)的抗生素提供具有科學(xué)依據(jù)的給藥劑方案被廣泛使用[22]。PK/PD模型與其他模型以及軟件的聯(lián)用為今后抗生素的合理使用提供了一種新的方向。通過相應(yīng)的藥敏試驗與PK/PD模型的聯(lián)用會為減緩細菌耐藥性的產(chǎn)生做出巨大貢獻。

本試驗從牛場病死犢牛體內(nèi)中分離出了致病性大腸桿菌，通過毒力基因檢測以及藥敏試驗確定了該株細菌的分型以及對何種抗生素敏感，為治療這株細菌引起的犢牛腹瀉提供合理的依據(jù)。與以往的細菌鑒定試驗相比，本次試驗測定了相關(guān)的毒力基因，從基因角度證明了該株大腸桿菌的致病性。

M. DL2000 Marker；1. 陽性對照1；2.陽性對照2；3. 分離菌株M. DL2000 Marker；1. Positive control 1；2. Positive control 2；3 Isolated bacteria圖2 細菌16S rRNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig 2 Results of bacterial 16S rRNA agarosegel electrophoresis

M. DL2000 Marker; 1. 陽性對照1; 2. 陽性對照2; 3. 分離菌株M. DL2000 Marker; 1. Positive control 1;2.Positive control 2; 3. Isolated bacteria圖3 K99基因 PCR 鑒定結(jié)果Fig 3 Identification of K99 gene by PCR