獸用消毒劑申報資料中殺滅微生物效力試驗探討

郭桂芳，溫 芳，劉自揚，徐 倩，王學偉，蘇富琴，梁先明

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

從動物的禽流感、豬瘟到人的重癥急性呼吸綜合征(SARS)、埃博拉疫情及新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)，不斷出現的新型傳染病和爆發流行，使得傳染病的防治受到前所未有的重視。化學消毒劑因其殺菌作用迅速、效果明顯、價格低廉，使用方便等特點，使其在控制和預防傳染病傳播方面得到廣泛的應用。因此，化學消毒劑是實現由被動治療到主動防治的一種重要手段。由于食品動物治療用藥的限制、微生物的耐藥性等因素，臨床對獸用消毒劑的需求越來越大。因此，探討獸用化學消毒劑的效力評價試驗，對規范和促進環保高效的獸用化學消毒劑開發具有重要指導意義。

1 獸用消毒劑概念、分類及管理類型及評審機構

1.1 獸用消毒劑 系指用于殺滅動物體表、畜舍、運輸車輛、獸用手術器械等傳播媒介上的微生物使其達到消毒或滅菌的制劑[1]。消毒(disinfection)系指殺滅或清除傳播媒介上病原微生物，使其達到無害化的處理。滅菌(sterilization)系指殺滅或清除傳播媒介上一切微生物的處理[2]。

1.2 消毒劑分類、管理類型及評審機構 在美國，將化學消毒劑分為兩種，用于處理低風險醫療器械和醫療器械表面的普通消毒劑(中、低水平消毒劑)；用于處理高、中度風險醫療器戒的高水平消毒劑。中、低水平消毒劑作為農藥—抗菌殺蟲劑(Antimi-crobial Products)進行管理，評審機構為美國國家環境保護局(FPA)，高水平消毒劑作為醫療器械(Ⅱ)進行管理[3-5]，評審機構為美國食品和藥物管理局(FDA)，在加拿大，消毒劑按消毒藥品(Disnfectantl Drugs)管理[6]，評審機構為衛生部-健康產品與食品檢驗局(Health Products and Food Branch)下屬的藥物理事會(TPD)；在歐洲管理類別為Ⅱa和Ⅱb類，評審機構為第三方認證機構；在澳大利亞管理類別為Ⅱb類[7]，評審機構為衛生和老齡部治療藥物管理局(Department of Health and Ageing Therapeutic Goods Administration)；墨西哥和厄瓜多爾(Ⅱ類)等國家和地區作為醫療器械管理；在中國消毒劑上市審批是由國家衛生和計劃生育委員會負責。

依據《獸藥管理條例》和《獸藥注冊辦法》，在我國獸用消毒劑是完全按照獸藥進行管理[8-9]。1992年農業部頒布了《獸用消毒劑鑒定技術規范》，詳細介紹了獸用消毒劑對細菌、芽孢、病毒等微生物作用效果評價的試驗方法。其中獸用消毒劑效力評價的試驗方法與衛生部頒布的《消毒劑技術規范》(2017年修訂版)基本相同。下面將針對獸用化學消毒劑(簡稱消毒劑)殺滅微生物的效力試驗所必須進行的實驗室殘留消毒劑(化學因子)的去除試驗、定性及定量殺菌試驗要求進行探討。

2 殺滅微生物效力試驗的依據

微生物殺滅試驗是評價各種用途的消毒劑對微生物的殺滅效果，是對消毒劑的殺菌能力進行驗證，《獸藥注冊辦法》規定，所有消毒劑均應進行殺滅微生物效力試驗。

2.1 殘留消毒劑(化學因子)的去除方法和中和劑的選擇 在開展微生物殺滅試驗前，必須先按受試微生物的種類分別進行相應的化學中和劑或其它殘留消毒劑去除法的鑒定試驗，以選出適宜的中和劑。需要說明的是試驗前細菌混懸液的制備及菌種的選擇至關重要。一般情況下，金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)作為細菌繁殖體中化膿菌的代表、綠膿桿菌(ATCC15442)作為感染最常分離的細菌繁殖體的代表；大腸桿菌(8099)作為細菌繁殖體中腸道菌的代表；枯草桿菌黑色變種(ATCC9372)作為細菌芽孢的代表、白色葡萄球菌(8032)作為空氣中細菌的代表。在上述規定的菌株基礎上，根據消毒劑特定用途或試驗特殊需要，還可增選其他菌株。在這里對細菌混懸液的制備不做詳細的介紹。

消毒劑殺菌效力評價試驗中，消毒劑與靶微生物作用終止后，消毒體系中殘留的消毒劑，可能對微生物的生長繁殖具有一定的抑制作用，從而導致對殺菌效果偏高的錯誤判斷，甚至產生假陰性的結果。因此在化學消毒劑的消毒試驗中，當達到規定的消毒時間終點時，應立即終止殘留消毒劑的繼續作用，以便準確檢測出消毒體系中殘留存活的微生物及其數量。殘留消毒劑的去除，可排除殘留消毒劑對微生物的抑制，從而使試驗獲得正確的結果。

2.2 去除殘留消毒劑方法的原則要求 可有效去除殘留的消毒劑；對微生物無害，不減少微生物應有的回收量；不破壞培養基的營養成份，不影響其透明度；必須按規定方法進行鑒定試驗，并認為合格者方可在相應的消毒試驗中使用。

2.3 去除殘留消毒劑的方法 化學中和法，又稱中和劑法，是指在消毒劑與微生物作用到達規定時間的終點時，取樣加于適宜種類和濃度的中和劑中，將殘留消毒劑迅速中和，使其不再持續殺滅和抑制微生物的方法[10]。本方法同時含有稀釋作用效果(至少1∶1稀釋，常用1∶10稀釋)，是最普遍使用的方法。去除殘留消毒劑的方法還有吸附法、連續轉種法、稀釋法、離心沉淀法或濾膜過濾法[11]。

2.4 中和劑選擇 選擇中和劑時，要根據微生物的敏感性來選擇，既要考慮微生物對中和劑的耐受能力，同時也要考慮消毒劑有效成分的濃度。中和劑選擇試驗中應選擇適宜濃度的消毒劑。當消毒劑濃度過高時，中和劑無法完全中和，或者在完全中和前殘留的消毒劑已經將微生物全部殺滅，無法正確鑒定中和劑；而當消毒劑濃度過低時，則不足以將高濃度消毒劑全部中和。所以，在選擇一種合適的中和劑時，要從消毒劑的性質、活性成分組成、試驗微生物、消毒試驗種類等多方面進行考慮。如含碘消毒劑常用的中和劑硫代硫酸鈉，當含量超過0.5%時對微生物特別是細菌的生長有明顯抑制作用。而復方含碘消毒劑由于含有多種活性物質，單一成分的中和劑可能難以滿足要求，需要采用復合中和劑，以中和所有活性物質[12]。

3 中和劑的鑒定試驗

3.1 中和劑的鑒定試驗設計原則 通過所設各組試驗結果綜合分析，應可確定所用中和劑是否對測試消毒劑有良好的中和作用，對試驗用細菌及其恢復期培養是否有害或不良影響；在確定用何種中和劑進行鑒定試驗有困難時，可對多個中和劑進行初選以確定。所用試劑，培養基及其它材料都應一致；試驗中所用消毒劑的濃度應以殺菌試驗中使用的最高濃度為準。濃度過低，則不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部中和；鑒定試驗中，消毒后去除殘留消毒劑組無菌生長，不能表明中和后細菌是否復蘇。此時可適當縮短作用時間再試，但作用時間最短不得少于30秒。否則難以控制試驗的準確性。若縮短作用時間后仍無菌生長，在排除其他原因的基礎上，可適當下調殺菌試驗中消毒劑的濃度，再次進行中和劑鑒定試驗；同一消毒劑擬對多種微生物進行殺滅試驗時，所用中和劑應按微生物種類分別進行鑒定試驗，不得取代。對細菌繁殖體的試驗，在大腸桿菌(8099)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、綠膿桿菌(ATCC15442)中任選其一進行試驗即可；對細菌芽孢，以枯草桿菌黑色變種(ATCC9372)芽孢進行。當用其特定微生物進行殺滅試驗時，均應以該特定微生物進行中和劑的鑒定試驗；鑒定時根據所用殺菌試驗方法，使用相應的懸液或載體定量試驗。

3.2 中和劑的鑒定試驗分組 在進行正式的中和劑的鑒定試驗前可進行中和劑的初選試驗，選中的中和劑95%以上均能通過正式的鑒定試驗。如果初選出多種中和劑，則應依次進行正式鑒定試驗，選其中效果最好者進行殺菌試驗。

以大腸桿菌8099和金黃色葡萄球菌C83707為指示菌，中和劑擬采用硫代硫酸鈉、吐溫-80的營養肉湯，使用前高壓滅菌。消毒劑用無菌硬水稀釋為一定濃度，稀釋液用0.03 mol/L的無菌磷酸鹽緩沖液，試驗一般分六組進行(表1)。根據試驗分組，準備足量試管和平皿，依次進行編號。各組分別用適宜大小的無菌定量吸管按規定程序吸取或添加試劑盒試驗樣本。

表1 選擇適宜中和劑及其濃度實驗方法Tab 1 Test methods for the selection of the neutralizers and concentrations

第1組：吸取1.0 mL試驗菌懸液與4.0 mL消毒劑置于試管內，旋渦20 s，混勻，作用至預定時間，吸此樣液0.5 mL加入含有4.5 mL稀釋液的試管內，混勻。吸取該最終樣液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養計數。

第2組:吸取1.0 mL試驗菌懸液與4.0 mL消毒劑置于試管內，混勻，作用至預定時間，吸此樣液0.5 mL加入含有4.5 mL稀釋液的試管內，旋渦20 s，混勻。作用10分鐘。吸取該最終樣液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養計數。

第3組：吸取0.1 mL試驗菌懸液與4.9 mL中和劑試管內，旋渦20 s，混勻，作用10分鐘。吸取該最終樣液0.5 mL，用中和劑做10倍系列稀釋，分別吸取每個倍數的稀釋液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養計數。

第4組：吸取0.1 mL試驗菌懸液與4.9 mL中和產物溶液(0.4 mL消毒劑+4.5 mL中和劑，作用10 min)置試管內，混勻，作用10分鐘。吸取該最終樣液0.5 mL，用中和劑做10倍系列稀釋，分別吸取每個倍數的稀釋液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養計數。

第5組：吸取0.1 mL試驗菌懸液與4.9 mL中和劑試管內，作用10分鐘。吸取該最終樣液0.5 mL，用稀釋液做10倍系列稀釋，分別吸取每個倍數的稀釋液0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養計數。

第6組：分別取中和劑、稀釋液、無菌硬水0.1 mL涂布于瓊脂平皿中，置37 ℃培養計數。

表2 中和劑鑒定試驗合格標準對第1組與第2組菌落數的要求Tab 2 The requirements of eligibility criteria for the numbers of bacterical colonies in groupl and group 2 in the identification test of neutralizers

3.4 注意事項 試驗所分各組均有其特定意義，不得任意刪減;嚴守無菌操作，保持試液和器材的無菌，注意更換吸管，以防止沾染影響試驗的準確性;在計算微生物濃度時，須考慮其稀釋倍數;試驗組序應按本規范所列排列。

4 消毒劑效果鑒定試驗

4.1 定性殺菌試驗 是測定受消毒劑作用后的樣本有無細菌生長的試驗方法，用于對消毒劑滅菌效果的鑒定和消毒劑殺滅細菌效果的初步評價。

4.1.1 試驗步驟 將制備的菌液進行活菌計數，然后用0.03 mol/L的無菌磷酸鹽緩沖液稀釋，使試驗菌液的含菌量為5×105cfu/mL～5×106cfu/mL。消毒劑用無菌硬水稀釋為所需濃度待用。將中號試管10支編好號排列于試管架上。第2至第10的試管中分別加入無菌硬水2.5 mL。于第1管加入稀釋并混勻的5 mL消毒劑，由第1管取2.5 mL至第2管，旋渦混勻后，再從第2管吸2.5 mL至第3管，以此類推，直至第9管，混勻后取出2.5 mL棄去，第10管不加消毒液作為對照。以每半分鐘加1管的速度將菌液2.5 mL置于每管內，使每管含菌量為106cfu/mL，旋渦混勻。在室溫條件下(20 ℃左右)作用5、10、15、30、60 min，至規定時間后，每管各取0.5 mL加入含4.5 mL中和劑的試管中旋渦混勻，中和10 min，再吸取出最終反應液0.5 mL加入4.5 mL液體培養基試管中。將接種最終反應液的液體培養基置37 ℃培養24 h，觀察細菌生長情況，若發生渾濁即表示有細菌生長。必要時，可移植到固體培養基上，觀察菌落形態，或進行涂片染色鏡檢，以判斷生長的是否為試驗菌，以排除污染。若肉湯不變渾濁，應繼續培養至第七天，若仍不渾濁方可判為無菌生長。

4.1.2 結果判定 以無菌生長管消毒液的最低濃度為最低殺菌有效濃度，以無菌生長管的最短消毒時間為該濃度殺菌最快有效時間。

4.2 定量殺菌試驗 在試驗室內測定消毒劑殺滅懸液中或載體上細菌繁殖體和細菌芽孢所需劑量，作為制定實用消毒劑量的參考。以殺滅率表示結果，用于對消毒劑殺滅效果的評價。

制備金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和枯草桿菌黑色變種芽孢懸液或菌片。此外，根據消毒藥物特定用途或試驗特殊需要，準備其他菌種的懸液或菌片。

消毒劑溶液除有特殊規定者外，應使用無菌硬水配制。消毒劑溶液濃度應以所含有效成份為準。例如，含氯消毒劑以所含有效氯濃度為準，碘伏以所含有效碘為準，過氧乙酸以所含過氧乙酸量為準，復方消毒劑濃度以主要殺菌有效成分的量為準。各組消毒劑溶液有效成分濃度的計算，應以菌藥混合液中有效成分的最終濃度為準。

4.2.1 試驗步驟 將制備的菌液進行活菌計數，然后用0.03 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋成含菌106～107個/mL的試驗菌液。消毒劑用無菌硬水稀釋至所需濃度。吸取0.5 mL試驗菌液加到4.5 mL待測濃度的消毒劑溶液中。置20 ℃水浴中5 min。立即吸取上述菌藥混合液0.5 mL，加入4.5 mL中和劑試管中旋渦混勻。中和10分鐘后，取最終反應液0.1 mL涂布于瓊脂平板，置37 ℃培養計數，進行活菌計數，計算殺菌率和殺菌指數。以0.03 mol/L的磷酸鹽緩沖液替代消毒液，同時進行上述各步驟，作為對照組。

4.2.2 結果判斷 殺菌率的計算：根據活菌計數的結果，計算殺菌率(Pt)。消毒t時的殺菌率(Pt)=【(N0-Nt)/N0】×100%，式中N0為消毒前或對照組的活菌數。Nt為消毒后或實驗組的活菌數。殺滅指數的計算：殺滅指數(KI)=N0/Nt。

4.2.3 注意事項 在殺菌試驗中，每次均應設置陽性對照。試驗中所使用的中和劑、稀釋液和培養基等，各批次均應進行無菌檢查，發現有菌生長，則全部試驗需換用未污染試劑或培養基重做。懸液定量殺菌試驗時，有機干擾物質一般采用3%(g/100 mL)牛血清白蛋白貯存溶液，取0.5 mL加入到消毒體系中(稀釋10倍)，進行消毒試驗。

4.2.4 判斷標準 目的為試驗消毒效能，殺菌率應達99.9%以上，當低于此指標時，則應提高消毒劑的濃度或延長作用時間。

5 討論與結論

定量殺菌試驗的消毒劑濃度設置是建立在定性殺菌試驗的基礎上的。由定性殺菌試驗結果，可得知將細菌或者芽孢完全殺滅的濃度范圍，也就是最低殺菌濃度與其后一個濃度之間。再在這個范圍內設置濃度梯度，做定量殺菌試驗，將目標濃度確定，準確找到殺菌率在99.9%以上的那個最低濃度[13]。但是在試驗過程中發現細菌數量變化對于結果的影響較大，為了保證結果準確性，需進行多次重復試驗，并棄去誤差率(平板間、稀釋度間)超過10%的結果，選擇可信結果再求其平均數，為最終結果[14]。