高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶預(yù)混劑中磺胺間甲氧嘧啶及甲氧芐啶的含量

陳錫龍，周澤曉，王慶紅，謝麗麗，郭 萍，古 海，焦仁剛，羅 楊

(貴州省獸藥飼料檢測(cè)所,貴陽(yáng) 550003)

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備 Thermo Scientific U3000高效液相色譜儀(配DAD檢測(cè)器)；色譜柱為Hypersil GOLD C18，(5 μm, 4.6 × 250 mm)色譜柱。Agilent 1260 infinity 高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器)；BP211D型電子分析天平(德國(guó)塞多利斯公司)；超聲波清洗器(KQ-300DE,昆山市超聲儀器廠)。

1.2 對(duì)照品 磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品來(lái)源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：C0031610，含量99.5%。甲氧芐啶對(duì)照品來(lái)源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0161210，含量100.0%。

1.3 原料藥 磺胺間甲氧嘧啶：吳江博霖實(shí)驗(yàn)有限公司提供，含量：97.38%；甲氧芐啶：壽康富康制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H37020335，批號(hào)：A-10111710094，生產(chǎn)日期：20171031，含量：99.3%。

1.4 試驗(yàn)樣品 共收集了5批2個(gè)不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶預(yù)混劑樣品，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)樣品信息Tab 1 Relative information of five Compound SMM Premix samples

1.5 試劑 甲醇、乙腈為色譜純；水為高純水；其他試劑均為分析純。

1.6 方法

1.6.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB C18(5 μm 4.6×250 mm)；柱溫為40 ℃；流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液-乙腈(86 ∶14)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm[5]；進(jìn)樣體積為20 μL。

1.6.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品50.43 mg，甲氧芐啶10.14 mg，置同一50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理10～20 min，取出，放冷，用甲醇稀釋至刻度，混勻，即得磺胺間甲氧嘧啶濃度為1.0036 mg/mL和甲氧芐啶濃度為202.8 μg/mL的磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對(duì)照品貯備液。精密量取上述混合對(duì)照品貯備液5 mL置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得磺胺間甲氧嘧啶濃度為100.36 μg/mL和甲氧芐啶濃度為20.28 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.6.3 供試品溶液的制備 取本品0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理10～20 min，取出，放冷，再加甲醇稀釋至刻度。另取上述稀釋液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

產(chǎn)業(yè)演變過(guò)程不僅通過(guò)產(chǎn)業(yè)集聚的組織形式對(duì)區(qū)域產(chǎn)生環(huán)境效應(yīng)，也通過(guò)產(chǎn)業(yè)網(wǎng)絡(luò)、產(chǎn)業(yè)共生等組織形式對(duì)區(qū)域生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響，相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)者已開(kāi)展了卓有成效的研究（王鋒等，2018）。基于455篇文獻(xiàn)計(jì)量分析和70篇代表性文獻(xiàn)分析，展望地理學(xué)、經(jīng)濟(jì)學(xué)、規(guī)劃學(xué)、環(huán)境學(xué)、社會(huì)學(xué)等學(xué)科對(duì)產(chǎn)業(yè)集聚環(huán)境效應(yīng)研究的拓展領(lǐng)域和方向。

1.6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取上述磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對(duì)照品貯備液各0.5、1、2、5、10 mL，分別置于5個(gè)100 mL容量瓶中，補(bǔ)足甲醇量為10 mL，再加水稀釋至刻度，得含磺胺間甲氧嘧啶濃度分別為5.02、10.04、20.07、50.18、100.36 μg/mL 和甲氧芐啶濃度為1.01、2.03、4.06、10.14、20.28 μg/mL系列混合對(duì)照品溶液。精密吸取各系列混合對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別以磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶色譜峰面積(Area)為縱坐標(biāo), 其相應(yīng)質(zhì)量濃度(Amt, μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得各自回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)。

1.6.5 含量測(cè)定 精密吸取上述1.6.2項(xiàng)中的磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對(duì)照品溶液及1.6.3項(xiàng)中的供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法定量計(jì)算供試品的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜圖 分別精密吸取磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對(duì)照品溶液及供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果表明：供試品溶液色譜圖中，在與混合對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰。

圖1 磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對(duì)照品及預(yù)混劑供試品溶液高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of reference substances or Compound SMM Premix sample

2.2 線性范圍 分別精密吸取上述1.6.4項(xiàng)中各系列梯度的磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)(Amt)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Area)，進(jìn)行線性回歸，得到磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶的回歸方程。結(jié)果表明：磺胺間甲氧嘧啶在5.02～100.36 μg/mL和甲氧芐啶在1.01～20.28 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 線性方程及相關(guān)系數(shù)Tab 2 Linear equation and related coefficient

2.3 重復(fù)性 精密量取含磺胺間甲氧嘧啶濃度為100.36 μg/mL和甲氧芐啶濃度為20.28 μg/mL的復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶混合對(duì)照品溶液及含量測(cè)定項(xiàng)下編號(hào)為SHGY1的供試品溶液各20 μL分別連續(xù)進(jìn)樣6次，以測(cè)定結(jié)果峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示試驗(yàn)的重復(fù)性，磺胺間甲氧嘧啶色譜峰面積的RSD分別為0.03%和0.13%，甲氧芐啶色譜峰面積的RSD分別為0.10%、0.20%，表明方法的重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 3 Test data of repeatability

2.4 準(zhǔn)確度 以所建立方法的測(cè)定結(jié)果同原永停滴定法測(cè)量結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算5批樣品磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶兩種方法測(cè)量結(jié)果平均值的相對(duì)偏差，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，兩種方法測(cè)量結(jié)果的相對(duì)偏差均不大于2.42%，方法具有較好的準(zhǔn)確度。

表4 準(zhǔn)確度測(cè)量結(jié)果(n=5)Tab 4 Accuracy results(n=5)

表5 耐用性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab 5 Durability test results(n=3)

2.6 專屬性 在對(duì)照品及樣品測(cè)試色譜圖中，甲氧芐啶及磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)出峰時(shí)間附近未發(fā)現(xiàn)明顯的干擾峰，甲氧芐啶與其前面雜質(zhì)峰的分離度為4.3，與磺胺間甲氧嘧啶峰的分離度為15.0；同時(shí)，經(jīng)DAD檢測(cè)器對(duì)兩個(gè)色譜主峰進(jìn)行識(shí)別和定位，均表明方法的專屬性良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取含磺胺間甲氧嘧啶濃度100.36 μg/mL和甲氧芐啶濃度為20.28 μg/mL的復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品溶液20 μL，分別約于0、24、48 h上機(jī)測(cè)定，每次進(jìn)樣兩針，磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶三次測(cè)量的色譜峰面積平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.36%和1.45%，結(jié)果見(jiàn)表6，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

表6 穩(wěn)定性測(cè)量結(jié)果Tab 6 Stability results

2.8 添加回收試驗(yàn) 以編號(hào)為SHGY1的樣品作為本底樣品，稱取約500 mg，精密稱定，精密添加磺胺間甲氧嘧啶原料藥(含量為97.38%)約50 mg和甲氧芐啶10 mg(含量為99.3%)，使兩者的添加量均達(dá)到原本底含量的約100%，按照供試品溶液的配制方法制成供試品溶液進(jìn)行含量測(cè)定，共做8個(gè)平行。按(實(shí)測(cè)含量-本底含量)/實(shí)際添加量×100%計(jì)算添加回收率，測(cè)得磺胺間甲氧嘧啶的回收率為98.83%～101.95%，平均回收率為100.53%，RSD為0.91%；甲氧芐啶的回收率為99.02%～103.09%，平均回收率為101.53%，RSD為1.23%，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 磺胺間甲氧嘧啶、甲氧芐啶回收率測(cè)量結(jié)果(n=8)Tab 7 Recovery rates of SMM and TMP(n=8)

2.9 樣品檢測(cè) 取5批試驗(yàn)樣品，按供試品溶液的制備方法分別制成供試品溶液后進(jìn)行含量測(cè)定，每批樣品作三個(gè)平行，結(jié)果見(jiàn)表8。結(jié)果表明，各批次磺胺間甲氧嘧啶的RSD均小于2.0%；甲氧芐啶的RSD相差較大，可能是其含量較低且有部分樣品沒(méi)有混勻的緣故。

表8 5批樣品中磺胺間甲氧嘧啶及甲氧芐啶含量測(cè)量結(jié)果(n=3)Tab 8 Content determination results of SMM and TMP in 5 samples(n=3)

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 當(dāng)前文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)量磺胺類藥物的高效液相色譜法所使用的流動(dòng)相系統(tǒng)有0.1%磷酸溶液-乙腈(90∶18,V/V)[6]、乙腈-甲醇-水-乙酸(2+2+9+0.2)[7]、0.017 mol/L磷酸-乙腈(80+20)[8]、磷酸鹽溶液-甲醇(65+35)[9]、甲醇-水-三乙胺(200∶799∶1,V/V)(用氫氧化鈉試液或冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.9)[10-11]等，柱溫主要有30、40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)多為270、240、230 nm。在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)磺胺間甲氧嘧啶對(duì)照品溶液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)磺胺間甲氧嘧啶最大吸收峰為295、250、230 nm，在285、270、215 nm處均有較強(qiáng)吸收峰。陳錫龍[12]采用流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液-乙腈(80∶20)檢測(cè)磺胺間甲氧嘧啶(鈉)的含量，認(rèn)為磺胺間甲氧嘧啶(鈉)的出峰時(shí)間適當(dāng)，峰形良好，且0.1%的磷酸溶液也容易配制。由于增加了對(duì)甲氧芐啶的檢測(cè)，流動(dòng)相的比例也應(yīng)作出適當(dāng)調(diào)整。檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)甲氧芐啶色譜峰的保留時(shí)間受流動(dòng)相比例變化的影響較大，即有機(jī)相增加，出峰時(shí)間提前，且峰形尖銳；有機(jī)相減少，出峰延遲，峰形變鈍。研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)檢測(cè)磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶時(shí)，采用流動(dòng)相0.1%磷酸溶液-乙腈(86∶14)效果最佳。但有專家認(rèn)為該流動(dòng)相酸性較強(qiáng)，有可能會(huì)損傷色譜柱。實(shí)驗(yàn)表明，該流動(dòng)相的pH值略大于2.0，約為2.05左右，滿足一般色譜柱對(duì)pH值的要求范圍，且自從2013年開(kāi)始使用0.1%磷酸溶液-乙腈流動(dòng)相系統(tǒng)研究檢測(cè)磺胺類藥物以來(lái)，未曾發(fā)生一例色譜柱受到損壞的情況。為使該0.1%磷酸溶液-乙腈流動(dòng)相系統(tǒng)(以下簡(jiǎn)稱磷酸-乙腈系統(tǒng))能被更加廣泛地應(yīng)用于檢測(cè)多種磺胺類藥物，研究還考察了其與甲醇-水-三乙胺(200∶799∶1,V/V)(用氫氧化鈉試液或冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.9)流動(dòng)相系統(tǒng)(以下簡(jiǎn)稱甲醇-三乙胺系統(tǒng))檢測(cè)不同磺胺藥物含量的比較情況，發(fā)現(xiàn)后者同樣能夠?qū)Χ喾N磺胺有良好的分離，但缺點(diǎn)是洗脫能力差，容易污染色譜柱，從而導(dǎo)致色譜柱柱效快速下降，使用壽命大大縮短。考慮到為保持將來(lái)磺胺類藥物檢測(cè)方法的一致性，同時(shí)也能夠獲得較好的分離效果，故選擇240 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，40 ℃作為色譜柱柱溫，0.1%磷酸溶液-乙腈(86∶14,V/V)作為流動(dòng)相。

3.2 樣品提取方法的優(yōu)化 對(duì)于樣品的提取方法，陳錫龍[13]采用加入1 mL的鹽酸溶解處理樣品后再加水定容的方法。但鹽酸的破壞力極強(qiáng)，可能會(huì)對(duì)樣品造成不可預(yù)知的破壞，也存在一定的安全隱患，同時(shí)，該方法處理樣品后需要迅速進(jìn)行稀釋，否則，磺胺間甲氧嘧啶特別是甲氧芐啶容易析出結(jié)晶，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果出現(xiàn)偏差。用甲醇提取樣品或溶解對(duì)照品時(shí)可獲得滿意的檢測(cè)效果，但要注意上機(jī)溶液中有機(jī)溶劑的比例不宜超過(guò)20%，否則，易產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，使甲氧芐啶的峰形變差，甚至出現(xiàn)分叉等，從而影響檢測(cè)結(jié)果。

3.3 高效液相色譜法測(cè)量結(jié)果比永停滴定法略低的原因分析 使用高效液相色譜法測(cè)量磺胺間甲氧嘧啶時(shí)，其結(jié)果往往要略低于傳統(tǒng)的永停滴定法測(cè)量的結(jié)果。分析認(rèn)為是磺胺間甲氧嘧啶在貯存過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定程度的降解，且其降解產(chǎn)物也屬于磺胺類物質(zhì)，使用永停法進(jìn)行測(cè)量時(shí)，儀器無(wú)法識(shí)別出該產(chǎn)物；而使用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)量時(shí)，該降解產(chǎn)物則能夠被很好地識(shí)別出來(lái)，即在前文圖1中磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶混合對(duì)照品及預(yù)混劑供試品溶液色譜圖中保留時(shí)間約為6.7 min(磺胺間甲氧嘧啶相對(duì)保留時(shí)間約0.48處)的較小的色譜峰，所以，高效液相色譜法測(cè)量結(jié)果比永停滴定法略低也就不難理解了。該降解產(chǎn)物經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，在238.8、265.0、288.6 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。其相對(duì)峰面積甚至可能高達(dá)10%以上。但是，關(guān)于該降解產(chǎn)物的性質(zhì)及其對(duì)藥品質(zhì)量會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響尚不清楚。

本研究建立的復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶預(yù)混劑含量的高效液相色譜測(cè)定法是可行的，該方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，精密度好，回收率高，可以作為復(fù)方磺胺間甲氧嘧啶預(yù)混劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中同時(shí)測(cè)定磺胺間甲氧嘧啶和甲氧芐啶含量方法的補(bǔ)充。