泰地羅新注射液在豬體內的藥代動力學及絕對生物利用度研究

宋婷婷，劉 靜，瞿紅穎，賈 興，耿智霞，郭李珉，劉 欣*，魏占勇，曹興元

(1.河北遠征藥業有限公司/河北省獸藥技術創新中心，石家莊 050041；2.中國農業大學，北京 100193)

泰地羅新(Tildipirosin)是一種新型十六元環動物專用的大環內酯類半合成抗生素，由英特威公司開發，而后被美國食品藥品監督管理局(FDA)批準在美國上市銷售[1]。它是泰樂菌素的衍生物，具有高效、廣譜的抗菌活性，對胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌和副豬嗜血桿菌引起的豬呼吸道疾病及溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌引起的牛呼吸道疾病具有很好的療效[2-4]。大環內酯類藥物通過與原核生物的核糖體蛋白50S亞基結合從而抑制細菌蛋白質的合成而發揮抗菌作用。一般而言，大環內酯類藥物不會與哺乳動物的核糖體結合，是一類相對較安全的獸用藥物[5]。

國外多年的生產和臨床應用表明，泰地羅新注射液在動物呼吸感染性疾病防治中具有廣闊的應用前景[6-7]。本試驗對泰地羅新注射液肌內注射和靜脈注射給藥后在豬體內的藥代動力學特征及絕對生物利用度進行了研究，旨在為獸醫臨床安全使用該藥提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯質譜儀：Acquity UPLC-TQD，美國Waters公司；TGL-15B型臺式高速冷凍離心機：上海安亭公司；HMA-50A 渦旋混合器：天津恒奧公司。電子分析天平：MS105DU型，感量0.00001 g，Mettler Toledo；天平：JY5002 型，感量0.01 g，舜宇恒平。

1.2 藥品與試劑 泰地羅新對照品：含量98.7%，河北遠征禾木藥業有限公司提供；泰地羅新-D10對照品：含量98.9%，購買自加拿大TRC公司；泰地羅新注射液：50 mL∶2 g，50 mL/瓶，河北遠征禾木藥業有限公司提供；乙腈、甲酸，均為色譜純；由Milli-Q超純水儀制取的超純水，符合GB/T 6682一級用水規定。

1.3 試液的配制

1.3.1 泰地羅新標準儲備液(1 mg/mL) 精密稱取適量泰地羅新對照品，用甲醇溶解并稀釋制成濃度為1 mg/mL的標準儲備液，置-20 ℃冰箱中保存。

1.3.2 泰地羅新標準工作液(10 μg/mL) 準確量取適量泰地羅新標準儲備液，用甲醇溶解并稀釋制成濃度為10 μg/mL的標準工作液，置-20 ℃冰箱中保存。

1.3.3 泰地羅新-D10(內標)標準儲備液 精密稱取適量泰地羅新-D10對照品，用甲醇溶解并稀釋制成濃度為500 μg/mL的標準儲備液，置-20 ℃冰箱中保存。

1.3.4 泰地羅新-D10(內標)標準工作液 準確量取適量泰地羅新-D10標準儲備液，用甲醇溶解并稀釋制成濃度為1 μg/mL的標準儲備液，置-20 ℃冰箱中保存。

1.4 試驗動物 16頭健康狀況良好的三元雜交豬，雌雄各半，3～4月齡，由北京畜牧總站試驗豬場提供，入選時體重為20.0～25.0 kg。所有試驗動物均被飼養在專用豬籠中，通過籠號進行標識，在入選當天被隨機分配1～16的編號，其環境條件適宜豬的生活。按常規飼養，自由飲水和采食，每天定量給予顆粒飼料。試驗前觀察1周，動物飲食、行為和體溫等臨床表現正常，有異常的動物，應剔除試驗。

1.5 方法

1.5.1 試驗設計與試驗方案 16頭受試豬隨機分成 A、B兩組，每組8頭，A 組動物的平均體重為23.64±4.85 kg，B 組動物的平均體重為24.09±4.99 kg。A組為肌內注射組，按照推薦劑量4 mg/kg BW給藥，B組為靜脈注射組，按照1/4推薦劑量1 mg/kg BW給藥。根據給藥前一天的體重稱量結果計算受試制劑的給藥量。

1.5.2 樣品采集 在每個給藥方式的不同時間點，從豬的前腔靜脈叢采血5 mL置于一次性肝素鈉真空采血管中。采血時間點如下：對于肌內注射給藥組和靜脈注射給藥組，均于給藥前及給藥后0.083 h、0.167 h、0.333 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 采集血樣，離心，分離血漿后于-20 ℃保存備用。

1.5.3 色譜條件 色譜柱：BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)；梯度洗脫；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

1.5.4 質譜條件 質譜儀：Waters XEVO TQD；離子源(ESI)：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；毛細管電壓：3.5 kV；脫溶劑氣流速：800 L/h；Q1、Q3均為單位分辨率。泰地羅新及泰地羅新-D10MRM質譜檢測參數見表2。

表2 泰地羅新和泰地羅新-D10質譜條件Tab 2 Mass spectrometry of tildipirosin and tildipirosin-D10

1.5.5 血漿樣品的處理 從冰箱中取出豬血漿，常溫解凍，搖勻后精密移取0.5 mL血漿，加入25 μL泰地羅新-D10內標工作液(1 μg/mL)，渦動10 s。加入乙腈2 mL，渦動2 min，使用高速冷凍離心機在4 ℃條件下以8000 r/min離心10 min，取出上清液。將以上提取液在50 ℃水浴下氮吹至近干。用初始流動相 0.5 mL溶解殘余物，渦旋混合，經0.2 μm濾膜過濾，待UPLC-MS/MS測定。

1.5.6 檢測限和定量限 在空白樣品中添加已知濃度的泰地羅新標準工作液，制成含泰地羅新不同濃度的加標試樣進行測定，重復操作5次，以能達到信噪比S/N≥3時樣品的最低濃度為血漿中的檢測限(LOD)，以能達到信噪比S/N≥10時樣品的最低濃度為血漿中的定量限(LOQ)。

1.5.7 標準曲線和線性范圍 分別設置5個不同濃度的標準工作液，依次為5、20、100、200、500 ng/mL(內標濃度為50 ng/mL)，依據設定濃度加入標準品，將所得泰地羅新峰面積與泰地羅新-D10峰面積的比值為縱坐標，以相應的泰地羅新濃度為橫坐標繪制標準工作曲線，得到相應的曲線方程與相關系數。

1.5.8 準確度與精密度 在500 μL空白血漿中加入泰地羅新標準工作液，制成含泰地羅新濃度為5、20、200 ng/mL的含藥血漿樣品。按照“1.5.5”項下的血漿樣品前處理方法進行處理，進樣分析。每日3個不同濃度，每個濃度重復6次，持續3 d，以樣品中藥物峰面積與內標峰面積之比，求得低、中、高3個濃度的回收率，計算各組變異系數，驗證方法的準確度與精密度。

1.5.9 穩定性 分別添加3個不同濃度5、20、200 ng/mL的泰地羅新標準品于血漿中混勻：對樣品進行前處理檢測，室溫24 h后以同樣的方法再次制備樣品進行前處理檢測，分析待測物在室溫的穩定性；每個濃度分成3份，置-20 ℃冰箱中，反復凍融3次后，與新鮮制備的血漿樣品同時檢測，分析待測物在凍融過程中的穩定性；樣品在進行前處理后，分別在0、8 h檢測樣品，分析前處理后待測物的穩定性；樣品在進行前處理后，分別在0、21 d進行前處理檢測，分析待測物在血漿中的穩定性。

1.5.10 基質效應 用流動相配制成濃度分別為低、高2個濃度(20、200 ng/mL)的標準工作液，作為基質效應考察的參照溶液，進行UPLC-MS/MS分析。取不同來源的空白血漿樣品，按照“1.5.5”項下進行樣品前處理，分別加入低、高2個濃度的標準溶液0.5 mL溶解氮吹后的殘余物，渦旋混勻，過0.2 μm濾膜，作為空白基質標準溶液，進行UPLC-MS/MS分析。

基質效應計算公式為：

ME%= A基質標準溶液/A參照溶液×100%

1.5.11 數據處理與分析 采用藥代動力學軟件WinNonlin6.4處理藥動學數據，進行非房室模型分析，求出各藥代動力學參數T1/2﹑Tmax﹑Cmax﹑AUC0-t和AUC0-∞等，以血藥濃度平均值對時間作藥-時曲線圖，并根據公式計算絕對生物利用度(FIM)。

FIM=(DoseIV/DoseIM)×(AUClastIM/AUClastIV)

2 結果與分析

2.1 方法學驗證

2.1.1 檢測限及定量限 經測定，本方法檢測限(LOD)為2 ng/mL，定量限(LOQ)為5 ng/mL。

2.1.2 標準曲線和線性范圍 結果顯示，泰地羅新在5～500 ng/mL的濃度范圍內線性關系良好，其線性方程Y=3.69137X+0.858636，r≥0.999。

2.1.3 回收率與精密度 對添加不同濃度泰地羅新的血漿樣品重復測定6次，共3個批次，其測定結果及計算所得的回收率與精密度見表3。由表中數據可知：泰地羅新在5、20、200 ng/mL 3個添加濃度水平下的回收率均在82.00%～109.99%，回收率穩定，批內變異系數≤5%，批間變異系數≤10%，精密度良好。

表3 血漿中泰地羅新回收率和精密度考察試驗結果(n=6)Tab 3 Recovery and precision test results of tildipirosin in plasma(n=6)

2.1.4 穩定性 樣品室溫放置24 h后進行前處理檢測，與新鮮制備的樣品相比，待測藥物的響應值的變異系數均低于20%；樣品反復凍融3次后，待測藥物的響應值的變異系數均低于20%；待測藥物在進行前處理后，分別在0、8 h檢測樣品，待測藥物的響應值的變異系數低于20%；待測藥物在進行前處理后，分別在0、21 d時待測藥物的響應值的變異系數低于20%。以上穩定性驗證結果均符合農業部第1247號公告的相關規定。

2.1.5 基質效應 經過試驗測定，泰地羅新在血漿低、高2個濃度樣品中檢測的基質效應在92.24%～100.58% 之間(RSD<3.12%)，故此分析方法的基質效應可以忽略不計。

2.2 藥動學結果

2.2.1 血藥濃度-時間曲線 豬肌內注射(4 mg/kg BW)和靜脈注射(1 mg/kg BW)泰地羅新注射液后，不同時間測得的泰地羅新注射液對應的平均血藥濃度-時間曲線見圖1。由圖1可知，泰地羅新在豬體內吸收迅速，在1 h內可達到最大血藥濃度；肌內注射泰地羅新的Cmax﹑AUC要大于靜脈注射泰地羅新。

圖1 豬肌內注射和靜脈注射泰地羅新注射液后的平均藥-時曲線圖Fig 1 The mean concentration-time curves after intramuscular injection and intravenous injection of Tildipirosin in pigs

2.2.2 主要藥動學參數 血藥濃度時間數據采用WinNonlin6.4 版藥代參數計算軟件進行非房室模型分析計算藥動學主要參數，見表4、表5。

表4 豬肌內注射(4 mg/kg)泰地羅新注射液后泰地羅新的主要藥動學參數(n=8)Tab 4 Summary of the mean plasma pharmacokinetic parameters in pigs administered intramuscular injection of Tildipirosin at the dose of 4 mg/kg body weight(n=8)

表5 豬靜脈注射(1 mg/kg)泰地羅新注射液后泰地羅新的主要藥動學參數(n=8)Tab 5 Summary of the mean plasma pharmacokinetic parameters in pigs administered intravenous injection of Tildipirosin at the dose of 1 mg/kg body weight(n=8)

2.3 絕對生物利用度結果 按照“1.5.11”項下公式計算泰地羅新注射液的絕對生物利用度，結果顯示肌內注射泰地羅新注射液的絕對生物利用度為77.15%。

3 討 論

3.1 方法學 本試驗建立了豬血漿中泰地羅新UPLC-MS/MS檢測方法，該方法中樣品測定靈敏度與準確度均較高，各項指標都能夠滿足測定要求。本試驗采用內標法進行標定，用泰地羅新-D10做內標物，能夠更好的對目標物準確定量，這與廖遠軍[10]報道的用泰樂菌素做內標物不同。

3.2 泰地羅新藥動學特征 泰地羅新注射液以4 mg/kg BW單劑量肌內注射于豬后，測得0～144 h泰地羅新的Tmax、Cmax、AUClast、T1/2λz、MRTlast分別為0.58±0.36 h、0.88±0.17 μg/mL、11.00±4.05 μg·h/mL、33.58±22.01 h、35.60±10.00 h。國外文獻報道[8]，豬按4 mg/kg BW單劑量肌內注射泰地羅新，Tmax為 23 min，Cmax為0.90 μg/mL，AUClast為11.01 μg·h/mL，與本研究結果基本一致。趙森等[9]等報道，藏香豬按4 mg/kg BW單劑量肌內注射泰地羅新，Tmax為0.45 h，Cmax為0.75 μg/mL，T1/2為120.51 h，AUC為22.22 μg·h/mL。廖遠軍[10]報道，豬按4 mg/kg BW單劑量肌內注射泰地羅新，Tmax為0.38 h，Cmax為0.97 μg/mL，T1/2為124.45 h，AUC為15.75 μg·h/mL。閆超群[11]等報道，豬按4 mg/kg BW單劑量肌內注射泰地羅新，Tmax為0.51 h，Cmax為0.87 μg/mL，T1/2為100.83 h，AUClast為19.70 μg·h/mL。與以上國內報道相比，其中Tmax、Cmax基本一致，但與趙森[9]和閆超群[11]等報道的T1/2、AUC有所差異，可能與動物品種有關。

泰地羅新注射液以1 mg/kg BW單劑量靜脈注射于豬后，測得0～144 h泰地羅新的AUClast、T1/2λz、MRTlast、Vz、Cl分別為3.56±1.62 μg·h/mL、50.91±23.47 h、37.53±4.52 h、17.59±8.09 L/kg、0.31±0.14 L/(h·kg)。上述數據表明，泰地羅新靜脈注射給藥后消除緩慢，分布容積大、血漿清除率低。此外，本試驗發現，在豬耳緣靜脈給藥后5 min，血漿藥物濃度較低，明顯低于給藥后10 min的血藥濃度(最高血藥濃度)，說明藥物從耳緣靜脈循環回心并進入體循環時存在一個短暫的延遲時間。

3.3 生物利用度 將肌內注射給藥后藥-時曲線下面積(AUClastIM)與靜脈注射后藥-時曲線下面積(AUClastIV)比較，肌內注射泰地羅新注射液的絕對生物利用度為77.15%，說明泰地羅新注射液肌內注射給藥吸收較好。該制劑的絕對生物利用度比已報道的稍低，可能與動物品種及個體差異有關。

4 結 論

本研究觀察到藥-時曲線在12～48 h血漿中的藥物濃度出現起伏波動，出現這種現象很有可能是由于大環內酯類藥物主要經膽汁排泄，存在肝腸循環等特點，進而出現“雙峰”。另外，個體間的差異也有可能出現此種現象。同時由于試驗豬機體的差異，脂肪囤積不同，以及肝腸和腎功能不同及試驗期間應激也可造成。

本研究闡明了泰地羅新注射液肌內注射和靜脈注射后在豬體內的藥代動力學特征及絕對生物利用度。試驗結果證實，按照4 mg/kg BW的劑量對豬肌內注射泰地羅新，吸收程度較好，為新獸藥審批和臨床使用提供了新的實驗數據。