柑橘黃龍病脫毒技術研究進展

黃 秀 徐建國 聶振朋 王 平 孫立方 孫建華 柯甫志

（浙江省柑橘研究所/國家柑橘品種改良中心浙江分中心 臺州 318026）

柑橘黃龍病是柑橘產業中最具毀滅性的病害之一，嚴重影響柑橘產業的健康發展[1,2]。因全球氣溫變暖造成的木虱繁殖和活動范圍加大以及柑橘嫁接、苗木的頻繁調運，致使黃龍病在亞洲、美洲、非洲等柑橘主產區泛濫成災[1,3]。如巴西圣保羅州南部橘區，黃龍病的發病率達到30%以上[5]，而美國佛羅里達州，自2005年首次發現黃龍病以來，種植面積和產量分別下降了38%和74%[3]，我國自20世紀首次在華南地區發現黃龍病以來，已有超過半數以上柑橘主產區受到為害，為害面積逐年增加，對我國的柑橘產業造成巨大經濟損失[6, 7]。

目前，世界范圍內對黃龍病的防治都沒有十分有效的手段。生產上多采用對媒介昆蟲木虱的防治檢測、砍除病株以及無病毒苗木的培育等手段預防黃龍病的發生和傳播[8,9]，其中無病毒苗木的培育也是控制黃龍病蔓延的重要前提。采用高效、簡便的脫毒技術獲得無病毒優質苗木用于提高柑橘產量和品質，對柑橘產業的健康發展至關重要。

本文對柑橘黃龍病以及柑橘主要脫毒技術的原理和研究進展進行闡述，為柑橘無病毒優良品種苗木的推廣和規?；l展提供理論基礎和技術參考。

1 柑橘黃龍病

柑橘黃龍?。–itrus huanglongbing pathogen，HLB）又稱青果病，由尚不能培養的韌皮桿菌屬中的一種革蘭氏陰性細菌引起的病害，根據病原體的不同主要分為三類，即亞洲種（Ca.Li.asiaticus），非洲種（Ca.Li.africanus）和美洲種（Ca.Li.americanus）[10]，目前在我國流行最廣、為害最嚴重的主要是亞洲種。亞洲種黃龍病菌在柑橘品種中流行趨勢隨季節改變而不同，在春季溫度和濕度利于黃龍病菌繁殖的環境下，癥狀明顯，傳染加劇；在溫度達到35℃以上的夏季，癥狀有一定程度的減弱。黃龍病菌主要寄生在根系、葉片等器官韌皮部組織的篩管細胞中，主要通過維管束和孢間連絲在樹體內傳播，在柑橘品種間通過接穗嫁接，木虱、赤眼蜂等傳播媒介等進行傳播。

柑橘樹體感染黃龍病后，篩管組織和韌皮部導管被堵塞甚至壞死，基因表達改變，淀粉合成增加并在葉片中積累破壞葉綠體結構和堵塞運輸系統，干擾營養合成以及轉運阻礙植物生長[11]，樹體嚴重衰弱，根系腐爛受損，出現葉片變小、斑駁或缺素癥黃化、小枝枯死、果實變小、畸形、有苦味等癥狀，落果現象嚴重，致使柑橘品質降低、產量下降[12,13]。

在感染黃龍病的早期階段，染病樹體往往有幾個月到幾年不等的無癥狀期，此時在田間用肉眼無法將其與健康樹木區分開，再者，染病樹體早期癥狀如嫩梢變黃，與缺鋅癥相似，果農容易對其做出不正確的診斷，以致染病樹體不能及時得到清除，成為無法預防的傳播源?，F在所有的商業柑橘品種均不抗黃龍病，存在被感染的風險[2,10]。而經脫毒后的柑橘苗木因本身不帶病毒，也無其他病蟲害的危害，苗木根系發達生長健壯，比普通苗木生長速度快、盛產期早、產量高、果實大且品質高、整齊度好等，受到廣大橘農推崇。因此，無病毒苗木的培育不僅是防治黃龍病的重要手段，也是提高柑橘產量和品質，促進柑橘產業發展的重要基礎和前提。

2 柑橘主要脫毒技術

目前柑橘脫毒技術主要有：莖尖嫁接，熱處理、化學藥劑處理以及近些年新出現的玻璃化法-超低溫脫毒技術等。

2.1 莖尖嫁接脫毒

柑橘莖尖嫁接技術已被證實可以脫除柑橘黃龍病等多種病害[14]，也是目前生產上用于獲得柑橘無病毒苗木比較常用的技術。主要依據病毒在植物體內分布不均勻性原理，將頂端分生組織不帶毒區域切下并嫁接到健康砧木上進行培育獲得無病毒植株。

自采用柑橘莖尖嫁接技術并用此法得到少量嫁接植株至今，已有很多人采用此法得到多種柑橘品種的無病毒植株，如Navarro等用此法成功培育出不含病毒的柑橘母本樹，并在生產上推廣種植無病毒苗，提高了柑橘品質和產量[15]。后又有研究人員對此法進行改進和優化，提高了嫁接成活率[16-18]。如José等[14]對柑橘莖尖嫁接脫毒技術進行優化，使病毒清除率提高到95%，莖尖成活率也達到50%以上[14]。陳毅群等[18]以 3個臍橙品種為試材進行莖尖嫁接脫毒條件優化，結果表明，以誘導離體枝條產生的不定芽進行莖尖嫁接的嫁接苗萌發率顯著提高，同時也解決了因季節原因造成的少芽和無芽問題。

采用莖尖嫁接法培育出的無病毒植株具有結果樹齡顯著縮短、無不良變異等特點，但莖尖嫁接法對試驗條件以及操作人員的技術水平要求極高，操作困難，嫁接過程始終有病毒清除率與莖尖存活率不能兼得的問題存在。

2.2 熱處理脫毒

熱處理脫毒利用病原體和寄主細胞對溫度耐受性不同的原理[2,17]，適當溫度的加熱使植物組織中的病原菌鈍化或死亡，使植物組織細胞不含病毒或無病毒區域增大，再對無病毒的植物組織進行后續培養成為安全的種質或繁殖材料。

研究表明，對感染黃龍病的樹體或接穗進行熱處理，能降低樹體或接穗中黃龍病菌含量并能在一定時間里保持無病狀態。如郭俊等[19]為清除尤力克檸檬接穗中的黃龍病菌進行不同溫度、不同時間的熱水浸泡處理，結果表明熱水處理能有效清除黃龍病菌、接穗無褐化且嫁接發芽率高達93.0%。Hoffman等[17]在溫室中對感染黃龍病菌的柑橘幼苗進行40～42℃連續熱處理至少48h后，經檢測熱處理能顯著降低或完全消除柑橘幼苗中黃龍病菌；之后對感染黃龍病的葡萄柚、甜橙、檸檬以及柚子的休眠芽進行為期 4個月的熱處理，得到24個經熱處理的休眠芽中只有3個在12月后呈現黃龍病陽性，而21個未進行熱處理的休眠芽有11個表現陽性，而且熱處理對休眠芽的萌發沒有明顯影響。

雖然熱處理對黃龍病菌有一定的抑制作用，但柑橘黃龍病的熱處理脫毒與熱處理時間、溫度以及柑橘品種有關[17]，苗木或接穗經熱處理后可能出現干枯、不出芽、死亡等情況，甚至有些樹在兩至三年后又重新出現病狀[17,19]，而且整株苗木進行熱處理，耗費大，操作繁瑣。目前，熱處理常作為一種預處理方式與莖尖嫁接結合脫除柑橘病毒。

2.3 化學藥劑處理脫毒

化學藥劑脫毒主要利用植物病菌對一些抗菌素的敏感性，抗菌素使病菌鈍化或死亡，從而抑制樹體病菌的繁殖和擴散，達到脫毒效果。

關于化學藥劑處理清除柑橘黃龍病菌的研究已經取得不小進步。祁鵬志[20]對10個柑橘品種的莖尖用20 mg/L病毒唑處理10 min，后經嫁接培養得到莖尖嫁接苗，經PCR檢測，結果均不含黃龍病菌。近年來，科研人員又對抑制柑橘黃龍病菌的候選藥劑展開篩選研究，并得到很多能不同程度抑制黃龍病菌繁殖的藥劑[21]。如Zhang等[22]采用嫁接法從五種化合物中快速篩選有效抑制黃龍病的潛在藥物，得到青霉素和鏈霉素混合物最能有效清除接穗中的黃龍病菌。之后Zhang等[21]又采用同樣方法從31種抗生素類抗菌劑中系統篩選對抑制黃龍病菌有效的藥物，得到氨芐西林、卡比西林、青霉素、頭孢氨芐、利福平、磺胺二甲氧嘧啶等多種抗生素均能有效地消除或抑制接穗中的黃龍病菌。

四環素、鏈霉素等抗生素類藥物雖能使黃龍病菌鈍化或部分死亡，但不能將其徹底根除，而且頻繁使用不僅增加生產成本，還可能導致抗藥菌的產生，對人類健康也存在潛在副作用[21,23]。隨著抗生素對公眾健康構成的巨大挑戰，人們著手在非抗生素藥物以及離子或納米顆粒中展開研究。Yang等[24]采用優化的嫁接技術從39種非抗生素抗菌藥物中，系統篩選得到8種（氫氧化鋁、D,L-丁硫氨酸亞砜胺、尼古丁、枯草芽孢桿菌表面活性劑、銀達因、膠體銀、EBI-601和EBI-602）有效消除或抑制黃龍病菌的非抗生素類抗菌劑，并被批準應用于農業生產。Jose等[25]對銀納米粒子殺滅黃龍病菌的能力進行測試，結果得銀納米粒子能降低樹體內黃龍病菌的濃度且殺菌能力顯著高于β-內酰胺類抗生素。這些非抗生素類抗菌劑、新型銀納米粒子等可作為清除黃龍病菌獲得無病毒苗的潛在候選藥物。

2.4 玻璃化法-超低溫脫毒

玻璃化法-超低溫脫毒是建立在玻璃化法-超低溫保存基礎上的一種新型脫毒技術，依據病毒在植物體內分布不均勻的原理，在液氮提供的-196℃超低溫環境下對含有病毒的分化細胞進行破壞，而不含病毒或病毒含量少的頂端分生組織在一定條件下恢復生長，達到脫去植物病毒的目的[26]。

研究表明，柑橘莖尖經玻璃化法-超低溫技術保存后可再生成完整植株[27,28]。Ding等[29]采用玻璃化法-超低溫保存技術從 5種不同品種的柑橘試管苗中成功清除黃龍病病菌，經后續培養得到健康植株，該方法的莖尖存活率達到76%以上，病毒清除率高達98.1%，而且該技術對莖尖大小要求不嚴格，莖尖大小在 1.5mm左右即可，降低了對操作技術的要求。曹慶等[30]研究表明，即使采用2.0～2.5 mm大小的柑橘莖尖，病毒清除率也能達到88.2%及以上。作為一種新型脫毒技術，玻璃化法-超低溫處理在柑橘脫毒方面具有很好的應用前景。

2.5 其他脫毒技術

此外，化學處理協同熱處理與莖尖嫁接技術結合，可獲得較好的脫毒效果。如陳傳紅等[31]在莖尖嫁接培育柑橘脫毒苗時，采用40℃高溫對 0.6 mm的莖尖進行處理，后經莖尖嫁接獲得的嫁接苗脫毒率高達93.21%，成活率亦達到63.32%，提高了莖尖嫁接脫毒效率。Yang等[32]用磺胺類抗生素清除柑橘黃龍病的同時進行45℃熱處理，表明45℃高溫處理可以增強柑橘的活力，促進根的生長，與單獨熱處理或抗生素處理相比，45℃高溫處理結合抗生素處理顯著降低幼苗中黃龍病菌含量，也說明協同作用比單獨的熱處理或藥劑處理效果更好。熱處理和化學藥劑與莖尖嫁接技術結合可提高脫毒成功率，主要是溫度、化學藥劑對感病接穗的預處理抑制了病毒繁殖和擴散，熱處理同時也提高了樹體對化學藥劑的吸收和利用效率，使長出的嫩芽莖尖生長點無毒區域相應變大，一定程度上降低莖尖嫁接過程對技術的要求，提高了病毒清除率和莖尖成活率。

除以上脫毒方法，還有珠心苗培育、愈傷組織等，通過培育珠心組織獲得無病毒苗木是柑橘脫毒最早使用的一種方法。但經珠心組織培育出的植株易發生變異成為變異品種，缺乏實際生產價值。再者，對于像紅美人、由良等優良無核柑橘品種，因花粉完全敗育，沒有種子形成，通過實生播種獲得珠心苗比較困難，因此生產上較少采用此法進行無病毒苗的培養。

3 展望

柑橘產業受黃龍病的影響，對其防治刻不容緩，而栽種無病毒苗木是預防黃龍病傳播的必要手段之一，因此需要迫切地建立一套高效、簡便、周期短的柑橘無病毒苗繁育體系。

在培育脫毒苗方面，科研人員付出很多努力，得到一些較好的培育方法。但也存在一定問題：(1)莖尖嫁接法脫除黃龍病菌對操作人員的技術水平要求極高，嫁接過程始終存在病毒清除率與莖尖存活率不能兼得的問題；(2)雖然如今研究得到的化學藥劑一定程度上使黃龍病菌鈍化，但不能將其徹底根除，仍沒有找到一種徹底殺死黃龍病菌的特效藥；(3)柑橘玻璃化法-超低溫脫毒技術具有高效、簡便、脫毒效率高等優點，但仍沒有建立起一套完整適用于生產的柑橘玻璃化法-超低溫脫毒技術體系，需要加強該方面研究；(4)現在脫毒苗的生產周期較長，一般條件下一個品種的脫毒至少需要兩年；(5)不僅要加強無病毒苗木培育的研究，還要加大生物技術在柑橘抗病品種培育中的應用，如利用基因編輯CRISPR/Cas 9、轉基因等技術，培育對黃龍病抗病品種，全面推動柑橘產業的健康發展。