SIRT6在非小細胞肺癌中的表達調控及對其抑制機理的研究進展

陳耀豐 黃志秋 魏曉群 溫業良

近些年來，肺癌成為了發病率最高的腫瘤，同時也是癌癥患者最常見的死亡原因之一，而非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最常見的類型之一，約占所有肺癌的80%[1]。統計分析顯示，約40%的NSCLC患者為疾病晚期，5年生存率僅為2%[2]。雖然近幾十年來肺癌的研究取得了很大進展，但其發病的分子機制仍不清楚。手術和鉑類為基礎的方案一直是早期NSCLC患者的主要治療手段。隨著腫瘤分子生物學研究的不斷深入，最新研究發現的新的治療藥物，如表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，在表皮生長因子受體發生突變的腫瘤患者中療效顯著[3，4]，但仍未明顯改善NSCLC患者預后，5年生存率仍不超過15%。因此，深入研究NSCLC 的發病機制，并尋找高療效的靶標藥物迫在眉睫。

Sirtuin 家族由7個成員組成，它們是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的蛋白去乙酰化酶和/或單核腺苷二磷酸（Adenosine di phosphate，ADP）轉移酶[5～7]。研究顯示，Sirtuins 在多種細胞的代謝過程中均發揮了重要作用，如細胞代謝、脂肪動員、炎癥應激反應、細胞凋亡、腫瘤發生發展等。作為去乙酰化酶，Sirtuins 將蛋白賴氨酸側鏈上的乙酰基轉移到輔酶NAD+上，生成去乙酰化底物OAADPr（2'-O-acetyl-ADP-ribose）和煙酰胺（Nicotinamide，NAM）[8]。在Sirtuins 家族中，SIRT6是多種過程的關鍵調節因子，包括DNA 修復、基因表達、端粒維護、新陳代謝和衰老。SIRT6 通過乙酰基和長鏈脂肪酸酰基(如豆蔻酰基)的脫酰作用，并成為單ADP-核糖轉移酶[9，10]。在小鼠中敲除SIRT6 基因后發現，基因缺陷小鼠體型變小，在嬰幼兒時期（2～3 周齡）即出現皮下脂肪丟失、前凸畸形等衰老相關表型，壽命均不超過4 周齡[11]。相反，SIRT6 基因過表達的雄性小鼠壽命明顯長于野生型小鼠[12]。IGF1 信號通路是調節壽命的關鍵因素[13]。因此，僅在男性SIRT6 過表達中觀察到的壽命延長可能可以通過IGF1 信號的減少來解釋。除了對壽命的影響外，SIRT6 基因過表達小鼠可以抵抗由肥胖所造成的一系列生理損傷，主要包括減少內臟脂肪的積累，提高脂質代謝水平、葡萄糖耐量和胰島素分泌等[14]。因此，SIRT6是連接能量穩態和壽命的調節器。本研究著重介紹SIRT6在NSCLC 的化療及免疫治療中的作用，初步闡述SIRT6 誘導NSCLC化療及靶向藥物耐藥機制，對SIRT6 作為NSCLC逆轉耐藥新靶點的可能性進行探討。

1 SIRT6 信號通路

人類SIRT6 基因由8個外顯子組成，定位于染色體19p13.3，分子大小為60～838bp[15]。在蛋白數據庫（PDB）中有57種不同的Sirtuins 晶體結構，其中4個是SIRT6。SIRT6是一種多功能蛋白，參與調控多種細胞和系統過程。除了與多個蛋白發生相互作用以外，它也有能力催化蛋白翻譯后修飾過程，從而影響蛋白表達和功能。因此，SIRT6 可以參與調控基因組的穩定性和DNA 修復，癌癥的發生發展過程、新陳代謝和老化。如何調控SIRT6 轉錄、表達和活性的機制是目前研究熱點之一。在營養脅迫下，SIRT1 可以正向調控SIRT6 表達水平，其主要機制是結合SIRT6 啟動子上的核呼吸因子1（NRF1）并形成復合物，從而啟動SITR6 蛋白翻譯過程[16]。FOXO3a 已被證明與壽命和調節代謝有關[17～19]。NRF1是一種正向調節關鍵代謝基因表達的轉錄因子[20～22]，另一個監管水平是P53 依賴。在正常營養條件下，P53 可以正向調節SIRT6 蛋白水平；但在饑餓狀態下，P53 可以與FOXO3a 結合，共同調控SIRT6 表達。SIRT6在饑餓狀態下也被上調[23，24]。這些發現提示SIRT6 的調控機制是由SIRT1 和FOXO3a 介導的。SIRT6 的另一個陽性轉錄調節因子是原癌基因c-Fos。c-Fos 與激活蛋白-1（AP-1）結合位點(TAAGTCA)在堿基對位置SIRT6 啟動子（promoter）上[25]。此外，SIRT6 蛋白水平被micro RNAmiR-33b 下調，而SIRT6 的3個非翻譯區（UTR）miR-33b 靶點的突變可以增加SIRT6的表達；而過表達miR-33b 則可以顯著抑制SIRT6表達，而通過anti-ir-33 抑制內源性miR-33b 則會增加SIRT6的表達[26，27]，說明miR-33b 在SIRT6 表達中發揮重要作用。

2 SIRT6在NSCLC 中表達

研究發現，SIRT6在非小細胞肺癌中的表達可能是一個有用的預后標記，而SIRT6 可能是預測肺腺癌化療敏感性的一個新的靶基因[28，29]。戴彭辰[30]研究結果顯示SIRT6在NSCLC組織及肺癌細胞中的表達顯著下降，而過表達SIRT6 可以抑制NF-κB的活化。同樣發現NSCLC患者癌組織中的SIRT6表達顯著低于正常組織，其機制可能與SIRT6 抑制EMT 轉錄因子Twist的表達，從而抑制NSCLC 細胞增殖有關[31]。除此以外，NSCLC患者癌組織和A549 細胞株SIRT6 mRNA 和蛋白水平均顯著低于癌旁組織和16HBE 細胞株，而過表達SIRT6 基因可以顯著抑制A549 細胞增殖，并促進細胞凋亡，其具體機制可能是通過抑制IGF1R/AKT 信號通過的異常活化，從而影響細胞增殖和凋亡[32]。深入研究其可能的分子機制發現，SIRT6 能抑制A549 細胞株和H1299 細胞株的侵襲和遷移，并抑制上皮-間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關標志物N-cadherin、vimentin 的轉錄水平，同時促進E-cadherin 轉錄；敲除SIRT6 基因后，A549 細胞株形態也發生明顯變化；除此以外，該研究發現SIRT6可以抑制NF-κB 信號通路，從而抑制A549 細胞炎癥反應[33]。其他研究顯示SIRT6在肺癌中的作用與其在細胞中的定位相關。NSCLC 臨床樣本中定位SIRT6 發現，腫瘤惡性程度更高的患者SIRT6 傾向于在胞質中高表達，而在細胞核內表達較低，說明SIRT6的表達位置可能與NSCLC 惡性程度有關[28]。研究發現，SIRT6 表達升高與臨床病理參數如T 和N 分類在NSCLC患者腫瘤中相關[34]。NSCLC 細胞系中的過表達SIRT6 基因可以增加細胞外信號調節激酶(p-ERK)1/2 的磷酸化水平，并激活基質金屬蛋白酶9(MMP9)，從而促進了腫瘤細胞的遷移和侵襲。研究報道SIRT6 基因缺失會抑制A549和H1299細胞中轉化生長因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導的EMT；而SIRT6能使Snail 蛋白發生乙酰化，阻止其蛋白酶發生降解，從而抑制NSCLC 細胞遷移和侵襲；與此同時，SIRT6 缺失會上調克魯普樣因子4（Kruppel-like factor 4，KLF4），并降低Snail 蛋白與KLF4 啟動子的結合，而KLF4 下調可以拮抗SIRT6 誘導的NSCLC轉移[35]。研究發現MiR-186 可以與NSCLC 細胞中SIRT6 mRNA 的3'-UTR 結合，靶向SIRT6，從而抑制NSCLC 的發展[36]。在人PC9 和H1975 NSCLC 細胞中，二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）誘導的細胞凋亡與SIRT6 激活Hedgehog 信號通路有關。該研究發現，DHA 可以顯著上調SIRT6 表達，下調Hh 信號通路，從而調控NSCLC 細胞凋亡。研究發現，長鏈非編碼RNAHMMR-AS1 可以抑制NSCLC組織中SIRT6 表達，導致NSCLC患者腫瘤生長并轉移[37]。

3 SIRT6 對NSCLC 化療或放療敏感性影響

蔡勇等[38]對過表達NSCLC 細胞株A549 中的SIRT6 基因研究發現，PKM2、LDHA 各HK 的mRNA表達水平均下降，培養基葡萄糖消耗速度降低，說明SIRT6 可以調控A549 細胞能量代謝，從而影響癌細胞對放療的敏感性。周子洋[39]研究發現，SIRT6 蛋白在NSCLC 中的表達顯著高于癌旁組織，SIRT6 可以抑制A549 細胞增殖和遷移，并影響其細胞周期，S 期縮短而G1 期延長，并能促進放射治療后A549細胞凋亡。而過表達腺病毒介導SIRT6 對NSCLC的A549 細胞有放射增敏作用，可抑制A549 細胞的增殖引起G0/G1 期延遲，誘導細胞凋亡[40]；而SIRT6基因下調會導致NSCLC患者對化療和放療敏感性增加，深入研究其可能的機制發現，通過抑制Raf-MEK-ERK 通路，cAMP 信號通路可以激活SIRT6的泛素-蛋白酶降解過程，抑制SIRT6 表達，提高細胞對放療藥物誘導的凋亡或自噬的敏感性[41]。近些年來關于SIRT6 與NSCLC 化療耐藥性之間的研究不多，但實驗證實，乳腺癌治療藥物紫杉醇及表柔比星可以引起乳腺癌細胞發生DNA 損傷，而SIRT6 可以抑制該過程，從而使乳腺癌細胞獲得耐藥性[25]；除此以外，有研究卻發現SIRT6 Ser338 位點發生磷酸化后會引起SIRT6 發生降解，抑制SITR6表達，從而抑制乳腺癌細胞對曲妥單抗的敏感性，而增加一個SIRT6 Ser338 位點非磷酸化的突變體則會增加乳腺癌耐藥株對曲妥單抗的敏感性[42]。因此，SIRT6在癌癥中可能扮演抑癌基因或促癌基因雙重角色，該基因與NSCLC 耐藥性的關系仍需要進一步實驗驗證。

綜上所述，SIRT6 信號通路在NSCLC 的發生發展中發揮重要作用。在大多數情況下，SIRT6 可以作為抑癌基因，控制NSCLC 的發生發展過程；但SIRT6 功能具有多樣性，大量體內外實驗證明上調或者下調SIRT6的表達都可以降低NSCLC 細胞的耐藥性，說明SIRT6 可以作為NSCLC 的潛在治療靶點，但其在NSCLC 中的具體作用機制仍需要更深入的研究。