表觀調控蛋白BRD4及其抑制劑在心肌纖維化中的研究進展

焦浩淼，崔 靜，高 歌，趙 文

鄭州大學藥學院/藥物研究院；教育部藥物關鍵制備技術重點實驗室 鄭州 450001

心肌纖維化是許多心血管疾病的早期改變，如高血壓、心肌梗死、病毒性心肌炎、動脈粥樣硬化、糖尿病等[1]；心肌纖維化可致心力衰竭、心律失常和心源性猝死等嚴重并發癥，因此預防和逆轉心肌纖維化是臨床治療中的關鍵點之一。已有研究[2]表明表觀遺傳學參與調控炎癥、免疫反應以及與心血管并發癥有關的基因的轉錄。BRD4是表觀調控蛋白BET家族的一員，其作用底物廣泛，可與多種蛋白相互作用，參與細胞的增殖、凋亡、炎癥反應等生物過程，因此BRD4與許多疾病的發生和發展密切相關[3]。盡管纖維化對心功能的影響已被廣泛接受，但目前還沒有針對性的抗心肌纖維化藥物。因此，對驅動心肌纖維化基本機制的深入了解，促進心肌纖維化新型療法的發展以及為研發治療心肌纖維化的藥物提供新的治療靶點具有重要意義。本文對最近幾年的研究進行總結，對心肌纖維化和表觀調控蛋白BRD4之間的潛在關系，以及它在控制纖維化前基因表達中的關鍵作用、靶向BRD4的小分子抑制劑在心血管疾病治療中的潛力進行綜述。

1 心肌纖維化

1.1心肌纖維化的病理學特征纖維化是由組織損傷或應激引起的一種典型的傷口愈合反應。在正常情況下，心肌纖維化是一種修復過程的結果，這種修復在心肌細胞損傷時被激活。大量心肌細胞的死亡將會激活修復程序，進而激活下游炎癥-纖維信號通路，導致纖維組織的形成[4]。例如，在急性心肌梗死中，大量心肌細胞的突然死亡會引發強烈的炎癥反應，最終導致以膠原性瘢痕代替死亡的心肌細胞，同時纖維瘢痕通過維護心室結構的完整性和防止擴張性重塑來保護心臟、防止破裂。雖然纖維化反應有助于穩定心肌損傷的局部區域，但過度的、彌漫性或慢性纖維化長期作用可能對心功能有不利影響[5]。

成纖維細胞起源于間充質細胞，分布于結締組織。鑒于成纖維細胞涉及“纖維化”的組織重塑，因此是與心臟疾病最顯著相關的細胞類型。在損傷部位，成纖維細胞活化為肌成纖維細胞，活化的肌成纖維細胞是心臟纖維化中纖維蛋白的主要來源，推動纖維化的進程[6]。肌成纖維細胞在長期負荷、炎癥、感染、代謝失衡和惡性腫瘤條件下被激活，進而引起細胞外基質出現纖維特性[7]，例如纖維膠原逐漸沉積，膠原分泌比例失調。多余膠原蛋白增加了心肌壁的硬度，并參與心室重構，從而阻礙心肌正常的收縮和舒張功能。

1.2心肌纖維化涉及的分子途徑

1.2.1 腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS) 血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)和醛固酮是RAAS的主要效應因子，它們通過不同的作用機制參與心肌纖維化的發生。巨噬細胞和成纖維細胞浸潤損傷的心臟，產生腎素和血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)，這些分子是生成AngⅡ所必需的[8]。在致心肌纖維化過程中，AngⅡ主要通過激活其Ⅰ型受體(AT-Ⅰ)促使多種分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和細胞外信號調節激酶(ERK)的激活[9]，進而誘導心肌細胞肥大、心肌成纖維細胞增殖、基質內膠原沉積。AngⅡ在促進膠原合成的同時，還能夠抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，影響膠原的降解。

1.2.2 轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β) 在哺乳動物中，TGF-β有3種亞型(TGF-β1、2和3)，由3個不同的基因編碼。盡管這3種TGF-β亞型通過相同的細胞表面受體發出信號并作用于相同的靶標，但它們卻有不同的表達形式。TGF-β1主要在心血管系統中廣泛表達，而其他亞型在特定的細胞和組織中有限表達。在正常心臟中，TGF-β1以復合物的形式存在，無法與其受體結合。心臟受損后，細胞外TGF-β1濃度主要是通過將其復合物轉化為活性形式來調節[10]。心臟TGF-β1過表達能夠誘導心室纖維化，增加膠原蛋白沉積和抑制間質膠原酶活性。TGF-β1能夠誘導成纖維細胞活化并增加細胞外基質蛋白合成。TGF-β1對其他類型細胞(如巨噬細胞、淋巴細胞)的作用可能以旁分泌的方式促進纖維化反應[11]。

TGF-β1可與細胞表面的組成型活性Ⅱ型受體(TβRⅡ)結合，形成異源二聚體復合物，該復合物可使組成型活性Ⅰ型受體(TβRⅠ)磷酸化激活，然后作用于R-Smad蛋白，Smad2和Smad3表達增加，同時磷酸化并與Smad4形成轉錄復合體，進入細胞核內，介導后續的細胞信號傳導。TGF-β1還可以通過刺激非經典Smad通路促進纖維化，例如MAPK通路[12]。

1.2.3 氧化應激 氧化應激是指在機體受到有害刺激時，體內高活性分子如活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基產生過多，氧化作用和抗氧化作用失衡的一種狀態。氧化應激通過直接作用以及細胞因子和生長因子信號轉導參與心肌纖維化的發病[13]。ROS通過調節基質蛋白的表達和代謝，直接調控細胞外基質蛋白的數量和質量。持續的氧化應激會激活心臟成纖維細胞的MMP，減少纖維膠原的合成。除了直接作用外，ROS也是細胞因子和AngⅡ誘導成纖維細胞作用的關鍵介質。AngⅡ激活下游的ROS敏感激酶，這些激酶在介導心肌纖維化的重構中至關重要。以線粒體為靶點，過表達過氧化氫酶(catalase，CAT)的小鼠心臟在AngⅡ灌注后對心肌肥厚和纖維化有抵抗作用，證明線粒體氧化應激介導了AngⅡ誘導的纖維化性心肌病[14]。

1.2.4 炎癥反應 心肌細胞的死亡迅速激活了固有的免疫途徑，觸發炎癥細胞因子、趨化因子和黏附分子的表達，導致白細胞浸潤并引發炎癥反應[15]。心肌纖維化與肥大細胞浸潤有關，心力衰竭和心室重構會引起肥大細胞數量增加。肥大細胞脫粒導致多種促纖維生成介質釋放，包括組胺、糜蛋白酶、肥大細胞特異性蛋白酶以及細胞因子和生長因子(TGF-β和TNF-α)，進而導致成纖維細胞的活化、增殖和分化[16]。隨著死細胞的清除、炎癥細胞凋亡和抑制性介質的激活，炎癥反應受到了控制。

2 BRD4

表觀遺傳學旨在研究在DNA序列不改變的基礎上的細胞表型和基因表達的差異。表觀遺傳調控主要包括組蛋白修飾、非編碼RNA、DNA甲基化和染色質重塑，其中組蛋白的翻譯后修飾近幾年研究的最廣泛。在染色質組蛋白位點上可發生特異性的翻譯后修飾，如甲基化、乙酰化、泛素化和磷酸化等，這些修飾靈活地影響著染色質的結構與功能[17]。含溴結構域蛋白是唯一可以識別組蛋白賴氨酸乙酰化修飾的蛋白。根據其序列的相似程度，這些含有溴結構域的蛋白分為9個家族，這些家族中最大的并且研究最多的是BET家族。BET家族由BRD2、BRD3、BRD4和組織特異性BRDt蛋白組成[18]，在其N末端具有兩個保守的含溴結構域(BD1和BD2)。BET蛋白識別乙酰化的組蛋白，并通過BD1和BD2與乙酰化的賴氨酸殘基結合來控制轉錄活性，從而充當蛋白質乙酰化的讀取器。同時，BET蛋白的N末端和C末端結構域可與轉錄因子和染色質組蛋白修飾劑結合，從而募集這些共同調節因子至啟動子或增強子位點以調節基因轉錄[19]。這些蛋白質位于細胞核中，調節細胞活動，包括基因轉錄、DNA復制和細胞周期進展，并因此參與腫瘤發生、感染、自身免疫和炎癥[20]，但它們之間的功能差異尚不明確。

3 BRD4參與心肌纖維化的調控

有學者[21]發現了一種有效且高度特異性的溴結構域抑制劑JQ1，該抑制劑可取代染色質上乙酰化賴氨酸的BET溴結構域來抑制下游基因表達。JQ1也一直被認為對多種惡性血液病細胞具有有效的抑制作用，包括多發性骨髓瘤[22]、急性髓細胞白血病[23]和伯基特淋巴瘤[24]，然而在非惡性細胞中研究較少。最近關于JQ1的一項專利值得關注，此專利發現通過使角膜基質細胞接觸有效量的JQ1或其衍生物，可以減少角膜瘢痕形成，或反轉、改善和治療角膜瘢痕[25]。多項研究表明，BRD4參與調控組織纖維化，BET家族抑制劑能夠有效地改善病理性纖維化反應，如JQ1能夠減輕博來霉素誘導的大鼠肺纖維化[26]和單側輸尿管梗阻引起的腎纖維化[27]。Song等[28]發現JQ1能夠減輕主動脈縮窄(transverse aortic constriction，TAC)、TGF-β誘導的內皮-間質轉化(endothelial mesenchymal transition，EndMT)和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成。EndMT是心肌纖維化的關鍵因素，是心肌成纖維細胞的重要來源之一。BRD4在壓力超負荷小鼠心臟內皮細胞中的表達上調，JQ1可以有效抑制TAC誘導的成纖維細胞增殖并起到一定的心臟保護作用。體外實驗[24]中，在臍靜脈內皮細胞(human umbilical veinendothelial cell，HUVEC)和小鼠主動脈內皮細胞(mouse aortic endothelial cell，MAEC)中，JQ1和沉默BRD4均有效地抑制了TGF-β誘導的遷移、EndMT和ECM合成，這與下調一組特異性針對EndMT的轉錄因子(Snail、Twist和Slug)、Smads途徑和TβRⅠ有關。在沒有TGF-β刺激的情況下，僅BRD4的異常表達也可以促進EndMT，加速遷移并增加ECM的合成。在體內試驗中，JQ1可抑制TAC誘導的EndMT和成纖維細胞增殖，這與JQ1在細胞內作用一致[24]。JQ1還能夠抑制心肌成纖維細胞激活標志物Postnd的表達[29]。這些發現，證實了BRD4參與調控心肌纖維化。

Stratton等[29]發現在TGF-β介導的心臟成纖維細胞活化過程中，BRD4的染色質動態靶向調控部分受MAPK的控制。BRD4可通過其末端羧基部位與細胞周期依賴蛋白激酶9(CDK9)結合并激活RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)，CDK9使PolⅡ尾部的絲氨酸磷酸化，導致轉錄延長，并激活下游靶基因(如SERTAD4)，進而引起成纖維細胞的活化和肌成纖維細胞ECM蛋白的大量積累，最終形成纖維化。SERTAD4是SERTAD蛋白家族的成員，也稱為調控周期蛋白依賴蛋白激酶SEI[30]。SERTAD蛋白的特征是存在保守的SERTA(SEI、RBT1、TARA)域。該家族成員可通過與CDK/細胞周期蛋白復合物相互作用來調節細胞周期的進程，還可以作為轉錄輔助因子來促進或抑制轉錄因子E2F的轉錄。SERTAD4是一種具有內在轉錄活性的核蛋白，最近研究[29]發現SERTAD充當Smad1的轉錄共激活因子，以刺激Smad/BMP靶基因的表達。TGF-β可上調SERTAD4的表達，敲低SERTAD4會減弱TGF-β誘導的心臟成纖維細胞活化標記的表達。因此推測，SERTAD4蛋白在Smad/BMP 通路中起正反饋作用，并通過Smad蛋白促進TGF-β依賴性基因表達，從而導致病理性心肌纖維化。然而目前僅發現SERTAD4與纖維化有聯系，其他基因是否參與其中仍未得知，需要進一步的探索。

在炎癥相關研究方面，JQ1能夠抑制MAPK/NF-κB通路，減輕脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)誘導的小膠質細胞[31]和血管內皮細胞的炎癥反應[32]。Jiang等[33]發現BRD4可抑制高遷移率族蛋白1(high mobility group protein 1,HMGB1)和NF-κB通路，有可能成為骨關節炎治療的潛在靶點[33]。因此靶向BRD4是治療炎性疾病的新方法。Bitzer等[34]的研究證實，小鼠胚胎成纖維細胞在受到LPS或促炎細胞因子TNF-α和IL-1刺激后，NF-κB/RelA通過激活Smad7基因轉錄誘導Smad7蛋白合成。Smad7在Smad家族中是一種特異性的內源性抑制因子，對TGF-β/SMAD信號轉導起負反饋調節作用，從而延緩纖維化的進程[35]。JQ1可通過抑制NF-κB/RelA信號通路，消除細胞因子誘導的肝星狀細胞的活化[36]。TGF-β能誘導細胞內源性Smad7的表達，但表達程度較弱，不能抵抗TGF-β活化R-Smads而產生的纖維化效應。BRD4參與調節p-TEFb(CDK9和細胞周期蛋白T的復合物)依賴性促炎靶基因的轉錄，是NF-κB轉錄共激活的必需。同時BRD4通過與細胞中的NF-κB亞基Rel A相互作用介導炎癥反應。感染、炎癥或損傷可以激活巨噬細胞，進而促進多種促炎介質的產生，例如ROS、一氧化氮(NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，以及多種促炎細胞因子(包括IL-1β、IL-6和TNF-α)。Belkina等[37]發現，LPS刺激巨噬細胞會引起BRD4表達升高，JQ1可使激活的巨噬細胞中關鍵炎癥基因表達下調，因此JQ1是一種有效的巨噬細胞激活調節劑。然而，這些炎性基因在JQ1單獨使用時不受影響。總體而言，這些結果表明BRD4可能是治療炎癥有效的靶標，并證明了在炎性疾病中進一步研究BET蛋白靶向基因的合理性。炎癥反應在心肌纖維化的進程中起到重要的作用。由于巨噬細胞表型和功能的多樣，使其有促纖維化和抗纖維化的雙重作用，其具體作用主要有參與反應的細胞亞型和微環境。所以，巨噬細胞的分化和激活可能刺激成纖維細胞的活化。

在多發性骨髓瘤實驗模型中，JQ1表現出較強的抗增殖作用，與細胞生長停滯和衰老相關，JQ1主要抑制致癌基因c-myc的表達[38]。c-myc是編碼多種基因轉錄因子的主要致癌基因，并參與細胞周期、細胞增殖和凋亡相關基因的調控；其作用不僅局限在腫瘤細胞中，在小鼠腎纖維化模型中，c-myc可直接與腎成纖維細胞整合素αV的啟動子結合，從而激活其轉錄，5個含有αV的整合素與不同的β亞基結合可以激活TGF-β[27]。抑制c-myc可減輕體內的腎纖維化，并在體外抑制腎成纖維細胞的增殖和活化；所以，靶向c-myc可能在腎纖維化的治療中具有臨床效用；在多囊腎病小鼠模型中，JQ1可通過抑制c-myc基因表達和囊性上皮細胞增殖來延遲囊腫增長[39]。因此JQ1是否能夠通過抑制c-myc的表達進而影響心肌成纖維細胞的增殖、改善心肌纖維化，值得進一步研究。

JQ1在TGF-β1誘導的氧化應激和Nox4介導的纖維化中也起到抑制作用[40]。綜合分析，以含溴結構域蛋白和纖維化驅動因子為抑制靶點可能對治療心肌纖維化有臨床益處。然而心肌纖維化涉及的機制復雜，BRD4與心肌纖維化之間是否存在更多的聯系也需要進一步研究。

4 BRD4抑制劑在心血管疾病中的應用前景

目前正在進行臨床試驗的BET抑制劑至少有23種，如抑制劑CPI-0610針對淋巴瘤[41]，I-BET762針對睪丸核蛋白中線癌[18]，OTX015針對急性白血病和非小細胞癌[42]。臨床前研究和臨床評估試驗結果顯示，在某些情況下，使用BET抑制劑治療癌癥同時也導致小腸表皮增生、細胞多樣性減少、干細胞衰竭、胃腸道局部毒性(腹瀉、惡心、嘔吐)、疲勞、高膽紅素血癥、血小板減少、貧血，以及腎臟損傷等不良反應，并且顯示出有限地抗腫瘤活性以及與細胞毒性相關的次級效應[43]。這些局限性提示我們需要在以BET蛋白為靶點基礎上尋求新的治療方法。近幾年的研究證實BRD4是纖維化反應的驅動因素，但是其作用不僅局限于心肌纖維化方面。越來越多的實驗數據顯示BRD4在心血管疾病中的重要作用，而這些正在進行的臨床試驗的結果將幫助我們了解BET抑制劑是否可以用于心血管疾病患者。

已有研究[40]表明，BRD4在大鼠心肌肥厚病理狀態下高表達,并且JQ1可減輕心肌細胞肥大，并證實了BRD4是導致心臟肥大這一病理過程中基因激活的重要誘導因子。Ma等[44]發現用siRNA敲低BRD4的表達后，可上調ApoA1表達，阻礙動脈粥樣硬化的發展和其他炎癥發生。在小鼠的主動脈橫向縮窄模型中，JQ1還能夠降低心力衰竭的多個主要特征基因(Myh7、CTGF、Nppa、Nppb和Rcan1)的表達[25]。以上研究進一步證實以BRD4為靶點的抑制劑應用在心血管疾病中的潛力。

BRD4的N末端具有兩個保守的溴結構域BD1和BD2，Kulikowski等[45]證實BD1和BD2在生物學功能和治療作用中的差異。穩態基因表達主要需要BD1，而由炎癥刺激誘導基因表達快速增加則需要BD1和BD2。BD1抑制劑在癌癥模型中表現出了廣譜BET抑制劑的作用，而BD2抑制劑主要在炎性和自身免疫性疾病模型中有效。治療動脈粥樣硬化和2型糖尿病的BRD4(BD2)選擇性抑制劑Apabetalone(RVX-208)[46]已在2型糖尿病和高風險心血管疾病患者中進行評估；從腎功能不全患者血漿蛋白的生物信息學分析表明，該抑制劑可以調節涉及免疫、炎癥、氧化應激、內皮功能障礙、血管鈣化和凝血等生物過程。RVX-208已被美國食品藥品監督管理局授予突破性療法認定，與最佳治療標準的他汀類藥物結合，可用于2型糖尿病和早期急性冠狀動脈綜合征患者主要心血管不良事件(major adverse cardiovascular events，MACE)的二級預防。盡管目前已經存在多種治療心血管疾病的藥物，例如降血脂藥(他汀類藥物)、降低心率藥(如β受體阻斷劑)以及降血壓藥物(如ACEI類)，但仍存在因患者接受該治療而出現MACE的較大殘余風險。RVX-208與包含他汀類藥物在內的最佳治療標準相結合這一新型療法，將有望成為糖尿病高危人群重要的差異化治療方法。到目前為止，RVX-208是BET抑制劑應用在心腦血管領域的第一個品種。

5 結語

心肌纖維化是一個復雜的病理過程，長期的壓力超負荷、氧化應激、炎癥反應等是其主要誘因，并涉及神經內分泌系統、免疫系統等[47]，其發病機制尚未研究透徹。BRD4是促纖維化BET蛋白家族中關鍵的成員，隨著RVX-208進入Ⅲ期臨床試驗，越來越多的研究人員開始關注選擇性BRD4抑制劑在心血管疾病中的保護作用，但是BRD4與心肌纖維化涉及的下游信號傳導還需要進一步探索；人們對BRD4抑制劑潛在毒性的擔憂，將指導開發更具選擇性的抑制劑而不是廣譜BET抑制劑。