lncRNA PTPRG-AS1通過調控PI3K/Akt信號通路對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響

張 靖，馮曉杰，白惠娟

鄭州大學附屬腫瘤醫院(河南省腫瘤醫院)婦瘤科 鄭州 450008

卵巢癌是致命的婦科惡性腫瘤之一[1]。目前，卵巢癌治療主要采用手術聯合輔助化療等方法，但由于手術局限性、化療耐藥性以及腫瘤復發轉移，晚期卵巢癌患者5 a生存率仍低于30%[2]。因此，了解卵巢癌的發病機制和分子改變對改善卵巢癌患者生存現狀具有重要意義。研究[3]表明長鏈非編碼RNA(lncRNA)在細胞增殖和凋亡調控等方面發揮著重要作用。lncRNA的表達異常與卵巢癌的進展有關。lncRNA生長抑制特異性轉錄本5(GAS5)在卵巢癌中表達下調，GAS5表達降低可促進細胞增殖、遷移和侵襲，提示卵巢癌預后不良[4]；lncRNA 性別決定區相關高遷移率族蛋白4(SOX4)在上皮性卵巢癌組織中表達上調，SOX4表達水平升高與腫瘤體積、腫瘤分級、轉移距離呈正相關[5]；lncRNA HOX基因的反義基因間RNA(HOTAIR)在卵巢癌中表達上調，敲除HOTAIR基因可抑制順鉑誘導的自噬，從而提高卵巢癌對順鉑的敏感性[6]。有研究[7]通過基因芯片篩選卵巢癌中差異表達的lncRNA發現，蛋白酪氨酸磷酸酶受體G基因反義鏈1(PTPRG-AS1)在卵巢癌細胞中表達上調。PTPRG-AS1是PTPRG的反義lncRNA，PTPRG可通過抑制PI3K/Akt信號通路抑制鼻咽癌的生長和侵襲[8]。本研究旨在探討PTPRG-AS1調控PI3K/AKT信號通路對卵巢癌細胞的增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑人正常卵巢上皮細胞HOSE，卵巢癌細胞株SKOV3、A2780、OVCR3購于中科院上海細胞庫；si-con、si-PTPRG-AS1以及PCR引物由上海吉瑪制藥技術有限公司提供；PrimeScript one step RT-PCR試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒購于大連TaKaRa生物技術有限公司；RIPA裂解液、MTT試劑盒、PVDF膜、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；RPMI 1640和opti-MEM培養基、胎牛血清為美國Gibco公司產品；兔源Cyclin D1、Bcl-2和Bax抗體為美國Abcam公司產品；鼠源Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K抗體為美國Santa Cruz產品；Trizol試劑、LipofectamineTM2000、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗為Invitrogen公司產品；胰島素生長因子-1(IGF-1)為美國Sigma公司產品。

1.2組織來源選擇2016年5月至2017年8月于我院確診并進行手術切除的41例卵巢癌患者的癌組織和配對癌旁正常卵巢組織。將卵巢癌和正常卵巢組織標本分成小塊，用不含RNA酶的磷酸鹽緩沖液洗滌后置于液氮中保存。患者均簽訂知情同意書，術前均未接受過化療或放療。本研究經我院倫理機構審查委員會批準。

1.3細胞培養、轉染和分組采用RPMI 1640培養基培養HOSE、SKOV3、A2780和OVCR3細胞，培養液中添加體積分數10%胎牛血清和100 U/mL鏈霉素/青霉素，培養條件為37 ℃、體積分數5% CO2、飽和濕度。細胞轉染：將對數期SKOV3接種于6孔板，待細胞約50%～60%匯合時，采用無血清培養基同步化12 h。取適量si-con或si-PTPRG-AS1加入Opti-MEM培養基中室溫孵育5 min，同時加入LipofectamineTM2000。然后將含有si-con或si-PTPRG-AS1的混合物分別加入SKOV3細胞中，依次標記為si-con組、si-PTPRG-AS1組，6 h后，更換含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，轉染48 h后，檢測轉染效果。轉染si-PTPRG-AS1 48 h后，用PI3K/AKT信號通路激活劑IGF-1處理細胞12 h，標記為si-PTPRG-AS1+IGF-1組。

1.4qRT-PCR檢測細胞中PTPRG-AS1mRNA的表達分別提取HOSE、SKOV3、A2780和OVCR3細胞總RNA，利用Prime Script one step RT-PCR試劑盒將RNA反轉為cDNA，采用SYBR Green PCR試劑盒利用Bio-Rad系統進行PCR擴增。引物序列：PTPRG-AS1上游為5’-GGGTAAGCGATC TACGCCC-3’，下游為5’-GTGGTTGCCCTCCTTAG GTC-3’；β-actin上游為5’-AAAGACCTGTACGC CAACAC-3’，下游為5’-GTCATACTCCTGCTTGCT GAT-3’。20 μL反應體系: 10 μL 2×SYBR Green Taq 6 μL的H2O，上、下游引物 各1 μL、2 μL cDNA。反應條件：94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 5 min。2-ΔΔCt法計算mRNA表達水平。實驗重復3次。

1.5MTT法檢測細胞增殖情況將各轉染組SKOV3細胞按照1×103個/孔接種于96孔板，每組設3個復孔，貼壁后加入20 μL MTT，再培養4 h后棄去上清，每孔加150 μL的DMSO，繼續孵育2 h至結晶溶解，利用酶標儀檢測490 nm波長處吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.6細胞凋亡檢測將SKOV3細胞按照1×106個/孔接種于6孔板，按照1.3方法進行轉染，48 h后，用胰蛋白酶消化細胞，用預冷的PBS液洗滌細胞2次，2 000 r/min離心5 min。收集細胞，用1×結合緩沖液重懸，取100 μL細胞懸液(約含1×105個細胞)，隨后分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI，混勻避光孵育10 min，補足至500 μL，混勻后上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.7Western blot檢測Cyclin D1、PTPRG、PI3K、Bcl-2、p-Akt、p-PI3K蛋白RIPA裂解液提取細胞總蛋白。取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，并轉移至PVDF膜，50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h，4 ℃條件下與一抗(Cyclin D1、PTPRG、PI3K按照1∶1 000稀釋，Bax、Akt按照1∶1 500稀釋，Bcl-2按照1∶2 000稀釋，p-Akt按照1∶800稀釋，p-PI3K按照1∶500稀釋)孵育過夜，PBS沖洗3次，加二抗室溫孵育2 h。利用ECL發光顯色，Image J分析各條帶灰度值，β-actin為內參。以目的蛋白和內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.8統計學處理采用SPSS 20.0分析，2種卵巢組織中PTPRG-AS1 mRNA表達的比較采用配對t檢驗，si-con和si-PTPRG-AS1組、si-PTPRG-AS1和si-PTPRG-AS1+IGF-1組SKOV3細胞各指標的比較采用兩獨立樣本t檢驗；4種卵巢細胞間各指標的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.12種卵巢組織中PTPRG-AS1mRNA的表達卵巢癌組織中PTPRG-AS1表達量(3.21±0.22)較配對癌旁正常卵巢組織(1.00±0.09)增加(t=62.056，P<0.001)。

2.24種卵巢細胞中PTPRG-AS1mRNA的表達卵巢癌細胞株(SKOV3、A2780、OVCR3)中PTPRG-AS1表達水平較正常卵巢上皮細胞HOSE升高(P<0.05)，見表1。

表1 4種卵巢細胞中PTPRG-AS1 mRNA的表達

2.32組SKOV3細胞增殖和凋亡比較si-PTPRG-AS1組SKOV3細胞PTPRG-AS1的表達水平較si-con組降低，提示抑制PTPRG-AS1表達的卵巢癌細胞株構建成功。與si-con組比較，si-PTPRG-AS1組SKOV3細胞Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達、細胞活力降低，Bax蛋白表達、細胞凋亡率升高，見圖1和表2、3。

圖1 2組SKOV3細胞增殖和凋亡相關蛋白的表達

表2 2組SKOV3細胞PTPRG-AS1 mRNA、增殖和凋亡的比較(n=3)

表3 抑制PTPRG-AS1的表達對SKOV3細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的比較(n=3)

2.42組SKOV3細胞PTPRG及PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達與si-con組比較，si-PTPRG-AS1組SKOV3細胞PTPRG蛋白表達升高，p-Akt、p-PI3K蛋白表達降低，見圖2和表4，提示抑制PTPRG-AS1表達可上調SKOV3細胞PTPRG蛋白的表達，抑制PI3K/Akt信號通路活化。

2.5激活PI3K/Akt信號通路對SKOV3細胞增殖和凋亡的影響與si-PTPRG-AS1組比較，si-PTPRG-AS1+IGF-1組SKOV3細胞Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達、細胞A值升高，Bax蛋白表達、細胞凋亡率降低，見圖3和表5、6。以上結果表明，激活PI3K/Akt信號通路能夠逆轉抑制PTPRG-AS1表達對SKOV3細胞增殖和凋亡的影響。

圖2 2組SKOV3細胞PTPRG及PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達

表4 2組SKOV3細胞PTPRG及PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達( n=3)

圖3 激活PI3K/Akt信號通路逆轉PTPRG-AS1 siRNA對SKOV3細胞增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

表5 激活PI3K/Akt信號通路對SKOV3細胞增殖和凋亡的影響(n=3)

3 討論

據統計，每年全球有20多萬婦女被診斷出卵巢癌[9]。因此，了解卵巢癌發生發展的分子機制，尋找新的有效治療方法對卵巢癌患者的精準治療意義重大。

lncRNA在轉錄和翻譯中起著重要的作用。PTPRG-AS1是近年來發現的新型lncRNA，PTPRG-AS1在乳腺癌組織中表達上調，與患者的預后和治療有關[10]；在膠質瘤細胞中，PTPRG-AS1通過靶向miR-185-5p調控膠質瘤細胞的生長[11]；在鼻咽癌中，PTPRG-AS1通過miR-194-3p分子海綿作用上調細胞質分裂調控蛋白1(PRC1)表達進而調控鼻咽癌細胞的放射敏感性和轉移[12]。然而，PTPRG-AS1在卵巢癌中的作用并未完全闡明。本研究結果顯示，與正常卵巢上皮細胞比較，3株卵巢癌細胞中PTPRG-AS1 mRNA的表達升高，與前人研究[7]相吻合。本研究結果亦表明抑制PTPRG-AS1表達后，SKOV3細胞增殖降低，細胞凋亡率增加促增殖蛋白Cyclin D1、抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax表達升高，提示PTPRG-AS1可作為卵巢癌治療的新型分子靶點。

PI3K/Akt途徑是許多信號分子下游信號傳導通路，其激活參與調控細胞增殖、侵襲和轉移和凋亡，與腫瘤的發生發展密切相關。近年來，大量研究表明，PI3K/Akt信號通路在卵巢癌中表現活躍，進而導致癌細胞的增殖和凋亡異常。Jin等[13]發現，lncRNA轉移相關肺腺癌轉錄本1(MALAT1)通過激活PI3K/AKT通路促進上皮性卵巢癌的增殖和轉移；王莉等[14]發現，利用siRNA干擾技術沉默高爾基體磷蛋白3(GOLPH3)可抑制PI3K/Akt信號通路進而抑制卵巢癌細胞的增殖，促進其凋亡。阻斷PI3K/Akt信號通路是遏制卵巢癌進展的關鍵策略[15]。反義鏈RNA是研究最廣泛的一類lncRNA，其通過與正義鏈的mRNA相互作用調控基因沉默、轉錄及mRNA的穩定性[16-17]。有研究[8]顯示，PTPRG通過調控PI3K/Akt信號通路參與對鼻咽癌細胞生長和侵襲的調控。PTPRG-AS1是PTPRG的反義鏈lncRNA，卵巢癌細胞系中PI3K/Akt通路異常[15]。本研究采用RNA干擾技術抑制PTPRG-AS1在SKOV3細胞表達后，p-Akt的表達水平下降，而PTPRG蛋白的表達升高；進一步研究發現，激活PI3K/AKT信號通路可逆轉抑制PTPRG-AS1表達對卵巢癌細胞的增殖和凋亡的影響。以上結果提示抑制PTPRG-AS1表達通過抑制PI3K/AKT途徑活化進而降低卵巢癌細胞增殖能力，促進細胞凋亡，其機制可能與調控PTPRG表達有關。但其具體調控機制還有待進一步深入研究。

綜上所述，lncRNA PTPRG-AS1在卵巢癌中表達上調，抑制lncRNA PTPRG-AS1表達可通過抑制PI3K/AKT途徑降低卵巢癌細胞增殖能力，并促進細胞凋亡。PTPRG-AS1有望成為一種新的卵巢癌治療分子靶點。