γδT17 細胞遷移在惡黑發病中的作用

孟祥慧 初金玉 王九妹 馬志紅 馬紅艷

【摘要】惡性黑色素瘤（Malignant Melanoma，MM）是由突變的黑色素細胞大量增殖而引起的一種惡性腫瘤。而其發病率約占到人體全身惡性腫瘤的 4%～5%。近幾年調查結果發現，惡黑正以每年 3%～5%的速度在逐年遞增，不容小覷。臨床上可通過各種途徑來診治惡性黑色素瘤，但目前最有效的方法還是早期診斷以及早期手術擴大切除、淋巴結清掃。然而，相當一部分黑色素瘤患者仍發生了癌細胞轉移，預后不良，五年生存率約為 20%。到目前為止，導致黑色素瘤發生的確切的分子機制，尤其是分子轉移機制在很大程度上仍然是未知的。腫瘤的免疫調控和免疫治療是近年來醫學領域的研究熱點，但學者們對MM 的免疫機制研究仍較少涉及。有研究發現，在惡黑中和周邊往往存在淋巴細胞，而Th17 細胞及其特異性分泌的細胞因子IL-17 在MM 中發揮極其重要的作用。 IL-17 是一種重要的炎癥介質， 與炎癥、腫瘤、過敏性疾病、自身免疫病等多種疾病的發生發展密切相關。其中γδ T 細胞作為免疫反應早期IL-17 的最重要來源，因其在多種感染性疾病和自身免疫性疾病中發揮重要作用而備受關注。本實驗將研究γδT17 細胞的聚集是否由于MM中促炎因子刺激分化和趨化因子誘導募集的結果。目的：探討MM 患者腫瘤、瘤旁和外周血γδT17 細胞與其他特異性T細胞亞型的相互作用，明確γδT17 細胞與患者預后及化療療效的相關性.方法：采用免疫組化和流式細胞技術檢測腫瘤組織、瘤旁組織γδT17細胞數量，并探討分泌IL-17 的T細胞之間的相關性結果：免疫組化結果顯示腫瘤組織中的γδT17 細胞數量均明顯高于瘤旁組織，流式細胞檢測結果顯示證實γδT17細胞內 CCL25 在惡黑組織中高表達。結論：惡黑腫瘤組織中的 γδT17 細胞遷移和富集可能是由 CCL25 介導的，在惡性黑色素瘤的發病中發揮重要作用

【關鍵詞】 惡黑;γδT17細胞;CCL25;趨化因子

黑龍江省省屬高等學校基本科研業務費科研項目 （2018-kyywfmy-0073）

1、材料和方法

1.1 收集臨床材料和標本 收集于2018年1月至2021年1月在我院行手術治療的30例皮膚惡性黑色素瘤患者;年齡41-68歲。同期就診我院的30例色素痣患者為對照組，年齡35-65歲，本研究經醫學倫理委員會審核批準。手術過程中收集癌組織和癌旁組織，用于石蠟組織包埋和提取單個核細胞用于免疫組織化學 流式細胞檢測。所需要的抗體均購于eB公司。

1.2流式細胞檢測 收集用于檢測的組織、外周血，分別經 ficoll 和 percoll

密度梯度離心富集淋巴細胞后，先染 viability dye 以排除死細胞，接著孵育細胞表面marker anti-CD4 和 anti-CD3 抗體，接著用 PMA（0.25?g/ml）、Ionomycin（0.25?g/ml）和 Golgi Stop 液處理細胞，然后固定破膜后加入抗體對 γδT17細胞和CCL25 進行染色。用 FACS Fortessa 流式儀進行上機檢測，收集實驗數據用lowJo 軟件進行分析γδT17細胞和CCL25的變化

1.3免疫組織化學 將包埋好的組織連續切成4μm 的切片，經過烤片、脫蠟、抗原修復、過氧化物酶滅活、加入一抗4攝氏度冰箱過夜、二抗37°孵育30分鐘、DAB顯色，蘇木素反藍、脫水、封片。以胞核中出現棕黃色或棕褐色著色為陽性表達，進行計數，統計。

1.4 統計學方法

數據采用 SPSS 21.0 統計軟件進行統計分析，計數資料用 x ±s 表示，采用 t檢驗，計量資料用例（%）表示，采用 χ2檢驗，相關分析采用 Spearman 秩相關檢驗。無進展生存時間計算采用 Kaplan-Meier 法和 Log-rank 檢驗，組間臨床資料的均衡性采用 χ2檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2、結果

2.1 γδT17細胞在惡黑細胞中的表達情況

在本組惡性黑色素瘤腫瘤組織中，γδT17細胞的陽性表達達90%以上，而在瘤旁組織中的表達相對較低占45%，在正常組織中表達不明顯。

2.2惡性黑色素細胞腫瘤組織中瘤旁組織中趨化因子CCL25水平

3 討論

惡性黑色素瘤發病率約占到人體惡性腫瘤的 4%—5%。調查發現，惡黑正以每年3%左右的速度在逐年遞增，因此對其潛在的發病機制研究和尋求 新的治療手段顯得尤為迫切。 腫瘤的免疫調控和免疫治療是近年來醫學領域的研究熱點，有研究表明，在多種惡性腫瘤和腫瘤轉移中往往存在淋巴細胞，而γδT17細胞及其特異性分泌的細胞因子 IL-17 在腫瘤發生和轉移中發揮極其重要的作用。

IL-17 是一種重要的炎癥介質， 與炎癥、腫瘤、過敏性疾病、自身免疫病等多種疾病的發生發展密切相關。早期的研究顯示活化的Th17 細胞主要通過分泌 IL-17（IL-17A）、IL-17F、IL-22、IL-21 等細胞因子發揮作用，并被認為是 IL-17 的主要來源[4]。然而 Th17細胞的作用機制并不能解釋在一些應激反應及宿主免疫早期起重要作用的 IL-17 的產生。事實上，γδT 細胞、NK 細胞、嗜中性粒細胞等多種固有免疫細胞均可產生 IL-17。這些細胞多分布于隔開宿主和外界環境的皮膚和粘膜組織，并在免疫系統中扮演哨兵的角色。其中γδ T 細胞作為免疫反應早期 IL-17 的最重要來源，因其在多種感染性疾病和自身免疫性疾病中發揮重要作用而備受關注[5]。

CCL25 為主要表達于胸腺和小腸上皮的趨化因子，其受體 CCR9 可以調節 CCR9 陽性細胞的趨化運動。近來研究表明，CCL25/CCR9 在多種腫瘤的生長、浸潤、轉移發揮作用。本實驗中我們發現在惡性黑色素瘤組織中存在CCL25和γδ TH17細胞的高表達，然后通過PI3K/AKT 途徑調控惡性細胞的凋亡。綜上所述，我們提出假說，所以我們認為，CCL25 可能誘導 γδT17 細胞向腫瘤組織遷移，該作用可能通過 CCL25/CCR9- BTLA- STAT5 信號途徑實現。

參考文獻

[1]Ren C，Li X，Wang T，et al.Functions and mechanisms of long non-coding RNAs inovarian cancer.Int J Gynecol Cancer，2015，25（4）：566-569.

[2]Clark MB，Mattick JS.Long non-coding RNAs in cell biology.Semin Cell Dev Biol，2011，22（4）：366-376.

[3].Harrington LE， Hatton RD， Mangan PR， Turner H， Murphy TL，Murphy KM， Weaver CT. Interleukin 17- producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol： 2005，6： 1123-1132.

[4].Zú?iga LA， Jain R， Haines C， Cua DJ. Th17 cell development： from the cradle to the grave. Immunol Rev：2013，252（1）：78-88.

[5].He D， Li H， Yusuf N， Elmets CA， Li J， Mountz JD， Xu H.IL-17 promotes tumor development through the induction of tumor promoting icroenvironments at tumor sites and myeloid- derived suppressor cells. J Immunol： 2010，184（5）： 2281-2288.

[6].Li B，Wang Z， Zhong Y， Lan J， Li X， Lin H.CCR9-CCL25 interaction suppresses apoptosis of lung cancer cells by activating the PI3K/Akt pathway.Med Oncol：2015，32（3）：66.