二氫楊梅素通過抑制HMGB1/TLR-4通路拮抗棕櫚酸誘導的內皮細胞衰老

劉思妤 劉嫣 歐陽杰

【摘要】目的 探討二氫楊梅素（DHM）對體外棕櫚酸（PA）誘導人臍靜脈內皮細胞衰老的抑制作用及其與HMGB1/TLR-4通路的關系。 方法 體外培養人臍靜脈內皮細胞株（ HUVECs） ，觀察不同濃度二氫楊梅素干預PA處理的HUVECs 衰老的變化。檢測細胞衰老、測定細胞上清液HMGB1、IL-6及IL-1β的含量、檢測TLR-4 的蛋白表達。 結果 PA處理內皮細胞 48h 能引起細胞β-半乳糖苷酶染色細胞增加，細胞上清液HMGB1、IL-6及IL-1β蛋白含量顯著升高，細胞中 HMGB1及TLR-4蛋白表達上調。與PA組比較，可以增加細胞活性; 降低細胞β-半乳糖苷酶染色陽性率、TLR-4蛋白的表達、細胞中IL-6及IL-1β釋放顯著減少，呈濃度依賴性。 結論 DHM對體外PA誘導的HUVECs 衰老有抑制作用，其作用機制與減少HMGB1釋放、下調TLR-4蛋白表達，從而減少炎癥釋放有關。

【關鍵詞】二氫楊梅素;HMGB1;TLR-4;HUVECs;棕櫚酸

基金項目：湖南省自然科學基金青年項目（2018JJ3480）;湖南省教育廳科學研究優秀青年項目（18B498）;湖南省衛生健康委科研課題（202102040901）;湖南省普通高校青年骨干教師培養經費（湘教通[2018]574號）;湖南省雙一流應用特色學科藥學學科項目（湘教通[2018]469號）資助。

糖尿病是一種以葡萄糖和游離脂肪酸水平升高為特征的代謝性疾病，其嚴重的心血管并發癥已成為威脅人類健康的主要因素。越來越多的證據表明，血管內皮細胞長期暴露在高脂血癥的環境中，會導致內皮提前衰老，并促進血管炎癥和動脈粥樣硬化，從而導致糖尿病并發癥的發生。炎癥的過量產生在細胞衰老中起著重要作用。高遷移率族蛋白-1（HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白，在高脂環境下HMGB1從細胞核中釋放，通過與晚期糖基化產物受體（RAGE）和Toll樣受體4（TLR4）結合，進一步觸發炎癥通路，發揮促炎作用。二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DHM）是藤茶中的主要黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、調血脂及降血糖等多種藥理活性。有證據表明DHM對心血管有保護作用，但DHM對糖尿病血脂異常狀態下引起的血管病變可能的有益作用尚未完全闡明。在本研究中，我們試圖證明DHM對棕櫚酸（PA）誘導的血管內皮細胞衰老和可能機制的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HUVECs（American Type Culture Collection，ATCC）;DHM、PA（Sigma公司）;DMEM高糖培養基、胎牛血清（FBS）和含EDTA胰蛋白酶（HyClone公司）;HMGB1、IL-6、IL-1βELISA試劑盒（博士德生物工程有限公司）;BCA蛋白質濃度測定試劑盒、β-半乳糖苷酶檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）;TLR4和β-actin一抗（博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

HUVECs在含有10 %的FBS及1 %青霉素/鏈霉素的內皮細胞培養基（DMEM）并于37 ℃，5 % CO2濕潤的環境下培養。待單層細胞貼壁達 85% 左右時，可進行傳代或后續實驗。

1.2.2 實驗分組

用DHM （ 0.1、1、10 μmol/L ） 預處理細胞1 h后，再加PA（0.3 mmol/L）干預48h。實驗分為：正常對照組、PA處理組、溶劑組、二氫楊梅素（0.1μmol/L） +PA處理組、二氫楊梅素（1μmol/L） +PA處理組、二氫楊梅素（10μmol/L） +PA處理組。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色方法及陽性細胞計數

按廠家說明書對細胞進行 β-半乳糖苷酶染色，于普通光學顯微鏡下觀察人工計數分析統計藍綠色的-半乳糖苷酶陽性細胞，結果以陽性細胞數/總細胞數100%表示。

1.2.4 酶聯免疫法測定IL-6、IL-1β的含量

按廠家說明書，用人HMGB1、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒測定不同處理后細胞上清夜中HMGB1、IL-6、IL-1β的水平。

1.2.5 Western blot 法檢測蛋白表達

所提細胞總蛋白經SDS-PAGE 分離后以β-actin 為內參照，兔抗羊TLR4 為一抗，通過Western blotting 法測定其TLR4 相對表達量，實驗重復3 次。

1.2.6 統計學方法

數據用SPSS 22.0 統計軟件進行處理，組間差異顯著性采用單因素方差分析（ One-Way ANOVA） 進行統計學分析，組間的兩兩比較采用LSD法，P< 0.05 認為有統計學差異。

2 結果

2.1 DHM對PA誘導內皮細胞衰老SA-β-gal活性的比較

與正常對照組比較，0. 3 mmol/L PA組SA-β-gal 陽性細胞率明顯升高（P < 0.01）。與PA組比較，內皮細胞SA-β-gal 陽性細胞率隨著DHM藥物濃度的逐漸提高顯著降低（P < 0.05 或P < 0.01）（ 圖1）。

2.2 DHM 對PA誘導內皮細胞 HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白釋放的影響

與正常對照組比較，PA組細胞上清液中HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白含量明顯增加 （P < 0.01）。與PA組比較，不同濃度DHM 組內皮細胞細胞上清液中HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白含量呈劑量依賴性降低（P < 0.05 或P < 0.01）（ 圖2）。

2.3 DHM 對PA誘導內皮細胞TLR4 蛋白表達水平的影響

與正常對照組比較，PA組TLR4蛋白表達明顯增加（P < 0.01）。與PA組比較，不同濃度 DHM組內皮細胞TLR4 蛋白表達呈劑量依賴性降低P < 0.05 或P < 0.01）（ 圖3）。

3 討論

本研究首次證明DHM可通過下調HMGB1及TLR4蛋白表達抑制炎癥釋放，從而減輕PA誘導的HUVECs衰老。內皮細胞衰老是動脈粥樣硬化的起始階段，研究表明，炎癥是誘導衰老的重要因素，而脂毒性刺激可以促進血管內皮細胞衰老。在這項研究中，我們用PA處理HUVECs，模擬糖尿病的血脂代謝病理應激狀態，也證實了PA能誘導HUVECs衰老。

血脂異常是動脈粥樣硬化的主要危險因素。PA可通過與TLR4輔助蛋白髓樣分化蛋白2直接相互作用促進血管損傷的發展。HMGB1是一種必要且充分的炎癥介質。當血管損傷時，它可以通過TLR4發出信號，最終導致NF-κB的激活，誘導促炎細胞因子的產生，從而促進炎癥。本研究發現PA損傷的血管內皮細胞中HMGB1釋放、TLR4的表達水平均高于正常對照組，同時炎性因子IL-6及及IL-1β 釋放增加。提示PA誘導的HUVECs衰老與HMGB1釋放、TLR4表達升高釋放炎性因子有相關性。

以往研究表明，DHM對血管內皮細胞炎癥損傷有保護作用[7]。我們的研究證明，DHM能有效降低PA誘導的內皮細胞β-半乳糖苷酶染色陽性細胞率，抑制細胞衰老。與此同時，DHM能顯著降低細胞上清液中炎癥因子IL-6及IL-1β的含量，減少HMGB1釋放及下調TNF4蛋白的表達。這提示二氫楊梅素改善PA誘導的HUVECs細胞衰老可能與HMGB1/TLR4信號途徑有關。

綜上所述，HMGB1的表達及釋放增加與PA誘導HUVECs衰老有密切關系。二氫楊梅素可以通過減少HMGB1的表達抑制TLR4蛋白表達，從而抑制炎癥的發生改善PA誘導的HUVECs的損傷，對降低糖尿病血脂紊亂引起的血管病變發生的風險具有潛在的應用價值。

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第一作者簡介：劉思妤（1981-），女，湖南郴州，碩士，副教授，主要從事中藥藥理學研究。