法醫學精斑檢驗方法新進展

程媛媛 李 樹

（中國刑事警察學院 遼寧·沈陽 110035）

精斑是精液射出于體外后浸潤或附著于某些載體上隨時間變化逐漸干燥形成的一類生物斑痕斑跡。

傳統檢驗方法有光譜法、酶催化法、化學法和傳統免疫學法等。光譜法包括交替光源照射法、拉曼光譜法等；酶催化法包括酸性磷酸酶檢驗、乳酸脫氫酶試驗等；化學法包括苦味酸結晶試驗和碘化鉀結晶試驗等；傳統免疫學法有前列腺特異性抗原檢測。這些方法操作簡便，但方法靈敏度和特異性有限，對檢材完整性要求高，檢驗結果不穩定且影響后續DNA檢測。

現代的精斑檢驗方法主要分為生物化學方法和分子生物學方法。

1 生物化學方法

1.1 免疫熒光染色和激光顯微切割技術檢測

目前大多對精子的可視化方法是基于組織學染色，但這些方法對精子并不特異，而且染色會導致DNA損傷。2009年Vandewoestyne等發現一種新的精子染色方法，即使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚等對精子頭部進行特異性免疫熒光染色，經室溫自然干燥后，使用激光顯微切割技術（laser capture microdissection，LCM）切割并捕獲熒光標記的精子。該技術是目前最先進、自動化程度最高的組織純化病理技術，可以精確分離精子和陰道上皮細胞。基于該檢測技術目前已研發出成品試劑盒，如Hy-LiterTMPI試劑盒。但是該方法切割精子過程易受設備功率、環境濕度和溫度以及精子細胞的數量等因素影響。

1.2 精液蛋白質質譜技術檢測

傳統的蛋白質組學研究主要是通過雙向電泳技術，在檢測親脂性蛋白質、相對分子質量過大或過小和微量蛋白上效果不理想。二維微量高效液相系統(2D-HPLC)、多維蛋白鑒定技術的發展解決了傳統方法的局限性，在不破壞DNA結構和節約樣本的基礎上，可以識別混合物中的特定成分，已應用在唾液和精液檢測。精斑檢測主要利用精子表面蛋白質質譜、精漿蛋白質質譜和差異蛋白質質譜等進行檢測。2013年Yang等用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀檢測出48個精液特有蛋白，如精囊蛋白（SEMG1/2）、PSA、前列腺磷酸酶（SAP）、半胱氨酸分泌蛋白等。但是部分蛋白質，如SEMG2等，不存在于無精癥患者的精液中，不適用該方法。

1.3 免疫磁珠法檢測

通過將特異性的抗體與磁珠進行結合，利用磁性分離技術達到對精液和陰道分泌液混合斑中精子進行捕獲和檢測。目前，精子特異性抗原對應的單克隆抗體及多克隆抗體的免疫磁珠結合的技術發展也已經很成熟。2011年國內學者利用抗 SPAG8抗體和人精子魚精蛋白抗體成功對精子細胞進行的捕獲和分離。免疫磁珠法具備了抗原抗體的較高特異性和其本身的固化性等優點，具有較好的法醫物證學進行精斑檢驗的應用前景。

2 分子生物學方法

精斑的確證檢驗和個人識別廣泛應用分子生物學方法。其中mRNA、miRNA、DNA甲基化應用于精斑的確證檢驗，Y染色體遺傳標記（Y-STR和Y-SNP）應用于精斑的個人識別。

2.1 精斑的確證檢驗

2.1.1 mRNA檢測

理論上，由于基因的選擇性表達，通過特定基因的mRNA表達進行檢測，獲得mRNA的表達譜，就可確證相應體液的存在。KLK3和PRM2基因分別在前列腺組織細胞和精子細胞中呈現高水平表達，而在其他組織器官中不表達或少有表達，具有特異性。根據這兩個基因的表達情況，可建立通過檢測特異性 mRNA標記進行精斑檢測的方法及標準。該方法具有操作簡便、快速，靈敏度高、特異性強等優點，但其與DNA分型技術不兼容。此外，由于RNA不穩定，所以陰性結果也不能排除有精子存在的可能性。

2.1.2 miRNA檢測

MicroRNA（miRNA）是一類真核生物體內內源性小分子的單鏈RNA，長度約為18-25nt，它能通過與靶mRNA堿基配對引起靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而進行基因表達調控。2009年Hanson等研究發現miR10b和miR135b在精斑中的表達量高于其他體液斑跡，而且在有月經血痕的混合斑和陰道拭子中也有較高水平的表達，可用于精斑確證檢驗。由于miRNA堿基序列很短，適用于陳舊、易降解的生物檢材的檢測。但該方法存在miRNA實時熒光定量PCR體系的假陽性率和假陰性率高，耗材昂貴，且與DNA分型技術不兼容等局限性。

2.1.3 DNA甲基化檢測

DNA甲基化主要見于CpG二核苷酸的胞嘧啶上，其檢測一般在 CpG二核苷酸相對集中的區域。眾多表觀遺傳學研究表明，通過利用人類基因組中組織特異性DNA甲基化的差異位點（tDMRs)可以對檢材來源進行鑒別。2013年AdamWasserstrom等將5個具有精液特異性甲基化差異位點和3個附加作為內部參照位點聯合起來，研發出第一個將tDMRs作為鑒定依據對人體組織或體液樣本進行精液斑識別的試劑盒，該方法類似于DNA分型技術。2012年劉峰等采用DNAIQTMSystem試劑盒成功檢驗了1例精斑。現階段各類研究篩選的位點數量有限、相關甲基化差異的多態性不高，遠不能滿足法醫實踐中識別生物斑跡類別的需要。因此，未來需篩選更多適用于各種體液鑒定的DNA甲基化差異性標記。

2.2 精斑的個人識別

在法醫學中，精斑及混合斑個人識別檢驗常用Y染色體遺傳標記，包括Y-STR和Y-SNP。此外，新一代測序技術日漸成熟，是目前精斑檢驗的研究方向和重點。

2.2.1 Y-STR檢測

Y-STR在強奸案、輪奸案的混合斑及少精子或無精子的混合斑中男性個體DNA檢測具有重要作用。當混合斑中男性精子遠低于女性陰道上皮細胞成分時(比例為1:25～1:50)，以及精液樣本存放時間過長、精子拷貝數低、檢材發生污染或降解時，Y-STR檢測可以排除這些因素對分型結果的影響。1999年Honda等利用4個特異的Y-STR位點，對保存長達25年之久的陰道拭子混合斑檢材進行了檢測，成功發現了罪犯。在輪奸案中，可利用分型結果一個基因座出現的等位基因個數推知最少作案人數，為案件的偵查提供線索。有研究報道，使用Y-STR檢測到多個男性成分的可能性大約是只使用常染色體STR檢測的三倍。

2.2.2 Y-SNP檢測

Y-SNP位點在人類基因組中分布廣泛，數目約比Y-STR位點要高出幾個數量級。研究發現，30～60個Y-SNP位點即能達到目前使用的Y-STR位點復合擴增系統的識別率。YSNP位點主要用于族源推斷，還可用于個體識別。Y-SNP檢驗手段主要有多重單堿基延伸SNP分型技術(SNaPshot)、飛行時間質譜技術(MassArray)，中高通量的SNPstream芯片技術和高通量的二代測序技術(NGS)等。有研究通過DNA微陣列進行SNP分型，發展了Y-SNP芯片，可用于混合斑及精斑的鑒定。但是目前多個Y-SNP位點的檢測體系仍在探索中，在日常檢測中有局限。

2.2.3 新一代測序技術

DNA測序技術可以檢測遺傳標記的結構，直觀而全面地展示核酸的深層次分子生物學信息。在混合斑及精斑檢驗中，利用二代測序對混合DNA進行STR基因座和SNP位點綜合測序，通過長度多態性和序列多態性，進而推斷混合DNA不同個體來源以及輪奸案中最少作案人數。二代測序技術在過去的二十年里發展迅速，并逐步實現了商業化。二代測序有高通量和成本低等優勢，但測序讀長較短，且相較于一代測序而言，二代測序時間長。因此，測序讀長長、時間短的三代測序應運而生，其不依賴于PCR擴增技術，為單分子測序。市面上三代測序平臺有美國 Heliscope BioScience公司的SMS技術和美國Pacific Bioscience的SMRT技術，VisiGenBiotechnologies公司的FRET技術以及英國ONT公司所推出的納米孔單分子測序技術。

3 展望

在性犯罪案件中，精斑作為法醫實踐中常見的生物物證檢材，其檢驗結果可以為偵查提供線索，為訴訟提供證據。隨著技術發展，二代測序的應用成為未來精斑個人識別技術發展的新趨勢。雖然現在有很多精斑鑒別新技術，但還傳統檢測方法輔助和大量試驗。