核因子E2相關因子2在腦缺血再灌注損傷中的研究進展

韓玉迪， 白 波， 王美琴， 朱 帆綜述， 李東芳審校

缺血性卒中是全球致死和殘疾的主要疾病之一，發病率逐年上升，嚴重危害人類健康，在時間窗內實現血管再通及組織再灌注是治療重點，有效的治療方法包括靜脈溶栓、機械取栓等[1]，然而再灌注后發生腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)可導致患者產生更為嚴重的神經損傷和功能缺損。在CIRI發生過程中，活性氧大量產生且清除不足，氧化和抗氧化作用失衡造成細胞、組織氧化損傷，氧化應激是CIRI的關鍵環節。核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是調控內源性抗氧化應激的重要轉錄因子，研究表明其介導的信號通路可通過抗氧化應激、抗炎、調節線粒體分裂和細胞凋亡、保護血腦屏障等多個途徑減輕腦缺血再灌注損傷，可作為治療缺血性卒中的新策略。現將Nrf2基本結構、調控機制及其在腦缺血再灌注損傷中作用的研究進展整理如下。

1 Nrf2的基本結構

Nrf2是具有高度保守的堿性亮氨酸結構bZip的對氧化應激敏感的轉錄因子，包含7個功能結構域(Neh1-Neh7)來調節其轉錄活性和穩定性。Neh1含有bZip序列，可與核內的小Maf蛋白形成異二聚體，使Nrf2能識別并結合抗氧化反應原件(antioxident response element,ARE)以啟動目的基因的表達,Neh1還可以與E2泛素結合酶相互作用以調節Nrf2的穩定性。Neh2含有DLG和ETGE兩個結合位點，可與Kelch樣環氧化氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)區域結合，促進Nrf2降解，負性調控Nrf2 的轉錄活性。Neh3位于Nrf2的C端，與細胞轉錄活性密切相關。Neh4和Neh5通過與轉錄共激活因子結合，在促進Nrf2轉錄中發揮協同作用，并且還通過與核輔因子RAC3/AIB1/SRC-3結合，增加Nrf2-ARE基因表達[2]。Neh6和Neh7調控Nrf2的非Keap1依賴性降解，并調節Nrf2的活性，β-轉錄重復包含蛋白1(β-TrCP1)介導的對Nrf2的降解依賴于對Neh6的識別[3],Neh7可特異性地與維甲酸X受體α(RXRα)相互作用來抑制Nrf2表達。

2 Nrf2的調控機制

Keap1是Nrf2的負性調節蛋白，正常情況下錨定在胞漿肌動蛋白細胞骨架上[4]，由CTR、NTR、BTB、IVR及DGR 5個結構域構成。BTB區，負責同源二聚化Cullin3(Clu3)，是Keap1與Cul3作用的區域，可介導Nrf2的泛素化及降解。IVR區含有大量半胱氨酸殘基，對親電試劑和氧化劑敏感，是Keap1蛋白的重要功能調節區域。DGR區又稱Kelch區，既是Keap1與Nrf2的Neh2區的結合位點，也是Keap1與胞漿肌動蛋白的結合位點。

在正常生理條件下，非活性Nrf2與Keap1-Cul3-Rbx1復合物結合被限制在細胞質中，這促進了Nrf2的泛素化和蛋白酶體降解，使其保持最低表達量，以維持動態平衡[2]。氧化應激時，在ROS作用下，Keap1半胱氨酸殘基氧化，構象發生改變，Keap1介導的Nrf2降解減少，Nrf2與之解離。還有一種門閂和樞紐學說，基礎條件下，Nrf2的DLG區和ETGE區均與Keap1的DGR區相結合，介導Nrf2的泛素化。當氧化應激時，結合力弱的DLG區從DGR區解離下來，但高親和力的ETGE區仍然結合與DGR區，占據了Keap1的位點卻不能使Nrf2降解，新生成的Nrf2因Keap1的結合位點飽和而不能與之結合，使Nrf2含量升高。Nrf2轉移至細胞核內與核內小Maf蛋白結合形成異二聚體，與ARE結合促進下游基因的轉錄及多種抗氧化酶及Ⅱ類解毒酶等的生成。

此外，Nrf2的激活還受到其他因素的調節。各種蛋白激酶對Nrf2的磷酸化也能影響Nrf2的活化。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號傳導和細胞外調節激酶(ERK)參與了Nrf2轉位，上調PI3K、Akt或ERK減弱均可激活Nrf2[5,6]。蛋白激酶C(PKC)對Nrf2 Ser40磷酸化促進了Nrf2與Keap1的解離[7]。自噬相關蛋白p62也可參與Nrf2的調節，p62作為一種選擇性自噬底物，正常情況下經自噬降解；氧化應激時p62上調可依賴哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mTORC1)與Keap1上的Nrf2結合位點相互作用，以實現Nrf2的穩定和激活[8,9]。此外，糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、β-TrCP、CpG甲基化、組蛋白磷酸化和乙酰化也調節了Nrf2的表達和活化[3,10～13]。

3 Nrf2在腦缺血再灌注中的作用

許多研究表明，在卒中急性期，Nrf2的表達顯著增加，且梗死周圍區較中心區水平更高[14]，可能是由于梗死周圍區的氧化應激高于核心區所致[15]。卒中后不同類型的細胞包括神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和中性粒細胞等，均會表達Nrf2，表達情況可能受時間影響。在再灌注8 h的梗死周圍區中，Nrf2在神經元中表達，而在星形膠質細胞或小膠質細胞中不表達[15]，在再灌注的24 h的梗死周圍區，Nrf2在神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞中均有表達。以上均表明Nrf2信號通路對腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)做出了應答。

與野生型小鼠相比，Nrf2基因敲除鼠進行短暫性大腦中動脈閉塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)造模后抗氧化酶、解毒酶的基礎活性和誘導活性均降低，梗死面積更大，行為學表現也更差[16]，更容易遭受缺血性腦損傷和神經系統損害。可見Nrf2在CIRI中起著頗為重要的作用。

3.1 抗氧化應激作用 由于腦組織需氧程度高且含有豐富的易被氧化的不飽和脂肪酸，抗過氧化能力及清除自由基的能力明顯低于其他組織[17]，腦I/R時大量自由基的生成誘發氧化應激，對腦組織造成損傷。Shah等人研究表明神經元中的Nrf2激活可由氧化應激誘導，激活了一系列抗氧化基因的轉錄[18]。已經證實腦I/R后Nrf2表達增高，誘導多種內源性抗氧化酶的產生，如醌氧化還原酶1(NQO1)、血紅素加氧酶1(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，從而減少或清除氧自由基，提高細胞、組織抗氧化能力[19]。給予Nrf2激活劑后腦組織內Nrf2及HO-1、NQO-1表達增多，SODs、CATs、GSH-Px和GSH活性升高，ROS活性及MDA含量減少，敲除Nrf2后上述保護作用被抑制，可證明激活Nrf2信號通路可通過抗氧化應激減輕CIRI[20]。

3.2 減輕炎癥反應 腦I/R后炎性細胞因子的過度釋放以及隨后的繼發性炎癥反應是腦損傷惡化發展的主要原因之一。Nrf2能負調節NF-κB(許多促炎基因的主要調控因子)信號通路，Nrf2基因敲除鼠的Toll樣受體4(Toll like receptor-4,TLR-4)和NF-κB的表達要高于受tMCAO作用的野生型小鼠，有更嚴重的神經功能缺損、梗死面積及炎性損害[21]。此外Nrf2調節的下游信號蛋白HO-1能將促炎游離血紅素催化分解生成等摩爾數的鐵以及抗炎化合物CO和膽紅素[22]，發揮抗炎作用。NOD樣受體蛋白-3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體在缺血誘導炎癥損傷中扮演著重要角色，硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)與NLRP3的激活密切相關，TNNIP在氧化應激下從硫氧還蛋白1(Trx1)/TXNIP復合物中解離出來[23]。Nrf2激活劑叔丁基對苯二酚(tBHQ)上調Nrf2顯著降低了tMCAO后TXNIP、NLRP3炎癥小體以及下游因子caspase-1、IL-1β and IL-18的表達[23]，增強血管生成和星形膠質細胞激活降低CIRI[24]。此外，激活Nrf2抑制了tMCAO后7 d內急性膠質細胞活化，7～14 d內發揮免疫調節作用，將梗死區中性粒細胞和T細胞的浸潤以及激活的小膠質細胞/巨噬細胞的數量減少50%以上[25]。

3.3 調節線粒體分裂和細胞凋亡 線粒體融合和分裂的平衡在維持神經元的正常功能中起著至關重要的作用，CIRI可以通過調節融合和分裂相關蛋白的表達和翻譯后修飾來破壞線粒體融合和分裂的平衡，從而破壞細胞內環境的穩態，導致神經元死亡[26]。線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1在線粒體分裂和融合中起重要作用,Drp1是線粒體分裂的執行蛋白，在細胞受刺激時被Fis1招募至線粒體外膜的特定位點持續收縮而分割線粒體,可以調節線粒體的數量、細胞能量的變化和及時處理受損的線粒體,線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1表達可以作為線粒體結構是否穩定的指標；促凋亡蛋白Bax與Drp1可共定位于分裂點上，Bax寡聚化形成孔道促進細胞色素C釋放和細胞凋亡，加劇神經元的損傷[27]。在腦I/R模型中，當Nrf2核蛋白被抑制之后，線粒體分裂相關蛋白指標明顯升高，線粒體形態損傷加重，凋亡率增高[27]。因此Nrf2介導的信號通路在腦I/R中作為內源性保護通路，抑制線粒體分裂，減少細胞凋亡，減輕腦損傷。

3.4 保護血腦屏障 血腦屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)的結構及功能正常是維持中樞神經系統內環境穩定的關鍵。腦I/R可以造成血腦屏障完整性破壞、通透性增加，進一步加重缺血腦組織的損傷[28]。Nrf2激活劑富馬酸二甲酯(DMF)可在體內實驗阻止內皮間緊密連接的破壞和縫隙形成，降低腦組織中的基質金屬蛋白酶活性，體外實驗維持內皮緊密連接，抑制炎性細胞因子表達，并減弱白細胞遷移，而Nrf2敲除加重了缺血狀態下緊密連接蛋白ZO-1離域并減弱了DMF的保護作用，表明了Nrf2在BBB完整性中的保護作用[29]，其他Nrf2激活劑，如蘿卜硫素(SFN)，也表現出了對血腦屏障的保護作用[30]。

4 小 結

Nrf2作為內源性抗氧化防御的關鍵成分，在體、離體實驗均證明激活Nrf2途徑的治療有利于減輕CIRI，涉及的機制包括抗氧化應激、抗炎、調節線粒體功能、抗凋亡、保護血腦屏障等，可減小梗死面積、減輕神經功能缺損，是缺血性卒中的高價值治療靶點。目前有越來越多的藥物表明可通過Nrf2途徑減少CIRI，但具體Nrf2的激活途徑、減輕CIRI的具體機制仍不明確，亟需我們進行進一步研究。總而言之，靶向Nrf2的卒中治療是一個很有希望的領域，但目前仍處于研究的初始階段，未來還需要進一步的討論和研究。