環狀RNA在腫瘤免疫中的作用研究進展

項桐偉 李紀鵬 俞萬鈞

環狀 RNA（circular RNAs,circRNAs）是一類單鏈閉環分子，缺少5'和3'末端以及多聚（A）尾巴，這使它們對核糖核酸酶R（ribonuclease R,RNase R）具有抗性并且比線性RNA更穩定[1]。circRNAs能夠通過吸附miRNAs、與 RNA結合蛋白（RNA-binding proteins,RBPs）結合、參與蛋白質翻譯調節等多種方式影響生理和病理過程[2-5]。circRNAs的異常表達與腫瘤細胞增殖、凋亡、血管生成、免疫逃逸等密切相關[6]。

人體的免疫系統通過免疫調節、監視和預防病原體的入侵來維持體內免疫穩定。由多種免疫細胞參與的免疫應答具有抗病毒、抗菌和抗腫瘤的功能。近年來的研究證明，非編碼RNA尤其是circRNAs是調節免疫疾病和免疫應答新的關鍵分子[7]。因此，本文就circRNAs與免疫細胞、免疫相關分子以及circRNAs在腫瘤免疫中的作用研究作一綜述。

1 circRNAs概述

1.1 circRNAs的生物學特性 circRNAs大小一般為100 bp至4 kb，最初被認為是異常RNA剪接的非功能性副產物。隨著新一代測序和生物信息學技術的進步，越來越多的具有調控功能的circRNAs被發現。circRNAs按其來源一般分為外顯子circRNAs、外顯子-內含子circRNAs和內含子circRNAs 3類。大多數外顯子circRNAs存在于細胞質中，而其他兩個主要存在于細胞核中[7]。

circRNAs具有以下特性，使其成為疾病診斷和治療的潛在標志物[8-10]。（1）高穩定性：circRNAs呈閉環結構，能耐受RNase R的消化，具有比線性RNA更高的穩定性。（2）高特異性：circRNAs表達具有組織特異性和疾病發展階段的特異性。（3）高保守性：大多數circRNAs在不同物種間的序列是保守的。

1.2 circRNAs的生物學功能 目前報道的circRNAs的生物學功能主要為以下4個方面。（1）充當miRNAs海綿：circRNAs含有大量miRNA應答元件，circRNAs可以通過吸附miRNAs，解除其對靶基因的抑制作用，從轉錄后水平調控基因表達。（2）與RBPs相互作用：RBPs是類蛋白質，它們與circRNAs一起進行基因轉錄和翻譯過程，并影響到circRNAs的加工、折疊和定位。（3）部分circRNAs可以和細胞核內的RNA聚合酶Ⅱ結合，在轉錄水平發揮作用[11]。（4）部分circRNAs可編碼蛋白：circRNAs最初被認為沒有蛋白質編碼能力，但是研究人員發現擁有內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）的 circRNAs具有翻譯的潛能[12]。如circ-ZNF609含了一個從起始位點到終止位點的開放閱讀框架，可以在小鼠成肌細胞中與核糖體結合，通過IRES位點驅動蛋白質翻譯[13]。

2 circRNAs在腫瘤免疫中的作用

先前的研究表明，腫瘤細胞、免疫細胞以及釋放的細胞因子之間的“crosstalk”可能參與腫瘤免疫的調節，并建立促進腫瘤發展的環境[14]。近年來發現cir-cRNAs在調節機體對腫瘤的免疫力中有巨大的潛力。

2.1 circRNAs與免疫細胞

2.1.1 circRNAs與巨噬細胞 作為先天免疫的重要組成部分，巨噬細胞對宿主的內環境穩定起著至關重要的作用，可以根據不同的免疫狀態改變宿主的表型和功能條件。哺乳動物巨噬細胞可以在不同的外部刺激下介導各種表型[15]。Zhang等[16]通過circRNAs芯片，對刺激極化的兩種不同模式的巨噬細胞（M1和M2）激活進行差異表達譜分析，結果顯示M1細胞中circRNA-003780、circRNA-010056 和 circRNA-010231高表達，而 M2細胞中 circRNA-003424、circRNA-013630、circRNA-001489和circRNA-018127高表達。該研究證實了circRNAs在不同極化狀態的巨噬細胞中表達的差異，為circRNAs在巨噬細胞分化和極化中的作用提供了新思路。Chen等[17]證實circ-FARSA的高表達預示著M2細胞的比例更高，更有利于非小細胞肺癌（non small cell lung cancer,NSCLC）的惡性進展。Hu等[18]發現circ-ASAP1與肝癌根治性切除術后的肺轉移有關，而circ-ASAP1能夠通過調節miR-326/miR-532-5p-CSF-1途徑介導腫瘤相關的巨噬細胞浸潤。

2.1.2 circRNAs與T淋巴細胞 Wang等[19]發現circRNA-002178能夠通過吸附miR-34增強程序性死亡分子配體-1（programmed death ligand-1,PD-L1）的表達，從而誘導T細胞衰竭。更重要的是circRNA-002178可以通過外泌體傳遞到CD8+T細胞，進而誘導程序性死亡蛋白1（programmed death 1,PD-1）表達。此外，Deng等[20]發現circ-LAMP1可以促進T細胞淋巴母細胞淋巴瘤的增殖，這種增殖效應可能是circ-LAMP1抑制了T淋巴細胞的凋亡。

2.1.3 circRNAs與自然殺傷細胞（natural killer cell,NK） NK細胞不同于T、B淋巴細胞，是一類無需預先致敏就能非特異性殺傷腫瘤細胞和病毒感染的細胞。Ma等[21]發現circ-ARSP91可以增加肝癌細胞對NK細胞毒性的敏感性，提示circ-ARSP91可以通過增強NK細胞的細胞毒性來增強先天免疫監視能力。相反，circ-UHRF1的高水平表達可導致NK細胞比例減少和NK細胞腫瘤浸潤減少，其機制為circ-UHRF1通過降解miR-449c-5p上調T細胞免疫球蛋白黏蛋白3的表達來抑制NK細胞功能[22]。

2.2 circRNAs與免疫相關分子

2.2.1 circRNAs與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF） VEGF在多種腫瘤中表達升高，已被認為是生理和病理性血管生成所必需的[23-24]。Zhong等[25]研究表明，circRNA肌球蛋白輕鏈激酶（circ-MYLK）可以通過吸附miR-29a減輕乳腺癌靶向血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）的抑制，從而促進腫瘤血管生成。此外，circ-SmarC5可與富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子1（serine and arginine rich splicing factor 1,SRSF1）結合，而SRSF1可以識別VEGF的近端剪接位點（PSS），并提高VEGFA的表達，從而促進腫瘤血管生成[26]。同樣，Ji等[27]經體內和體外實驗證實circ_001621通過miR-578/VEGF信號通路上調細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）和基質金屬蛋白酶9的表達，促進了骨肉瘤的增殖和遷移。

2.2.2 circRNAs與IL IL在激活與調節免疫細胞，介導T、B細胞增殖與分化及在炎癥反應中起重要作用。Liu等[28]發現miR-495是circ_0000372的海綿分子，而IL-6是miR-495的靶基因。circ_0000372通過miR-495/IL-6激活JAK2/STAT3信號通路促進了結直腸癌的發展。Wang等[29]發現circ-RBM33和IL-6在胃癌組織和細胞系中表達升高，并與胃癌的臨床病理特征密切相關，circ-RBM33通過吸附miR-149促進IL-6分泌，從而促進胃癌細胞的增殖和侵襲。

2.2.3 circRNAs與 IFN-γ IFN-γ由 T淋巴細胞分泌，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調控的作用。Yan等[30]發現IFN-γ可以誘導前列腺癌細胞發生上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），使用高通量測序分析IFN-γ對circRNAs表達的影響，結果顯示，與未經過IFN-γ處理的細胞相比，IFN-γ處理組上調的circRNAs有827個，下調的circRNAs有1 279個。進一步研究發現其中的circ_0001165可通過hsamiR-187-3p/TNF通路，circ_0001085可通過 miR-196b-5p/PI3K-Akt通路間接參與IFN-γ誘導的前列腺癌細胞EMT。

2.3 circRNAs與腫瘤免疫治療

2.3.1 PD-1/PD-L1 PD-1是一種重要的免疫抑制分子，為免疫球蛋白超家族，是一種有288個氨基酸殘基的膜蛋白。PD-1與其配體PD-L1的結合介導T細胞活化的共抑制信號，可以抑制T細胞的殺傷功能，對人體免疫應答起到負調節作用。因此，以PD-1/PD-L1為靶點的免疫調節對抗腫瘤有重要的意義[31]。Zhang等[32]在 NSCLC組織中發現circ-FGFR1的表達促進了NSCLC細胞增殖、侵襲和免疫逃避。其機制為circ-FGFR1能直接與miR-381-3p結合并作用于miR-381-3p的靶基因趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4），促進了NSCLC的進展和對以抗PD-1為基礎的腫瘤免疫治療的耐藥。Hong等[33]發現circ-CPA4和PD-L1在NSCLC中高表達，敲除circ-CPA4可以抑制細胞生長、遷移和EMT，并通過下調PD-L1來促進NSCLC細胞死亡。在肝癌中，染色體7q21-7q31的擴增與肝癌的復發和多藥耐藥性有關。Huang等[34]報道該染色體區域的擴增激活了circ-MET的表達，circ-MET通過Snail/DPP4/CXCL10軸誘導肝癌細胞免疫耐受。

2.3.2 細胞毒性T淋巴細胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4,CTLA-4） CTLA-4是位于活化的T細胞表面的一種跨膜蛋白。CTLA-4作用于免疫反應的啟動階段，其激活能夠抑制T細胞免疫應答的啟動，從而導致活化的T細胞減少并阻止記憶性T細胞的生成[35-36]。Zhao等[37]研究了競爭性內源性RNA網絡在胰腺癌發生、發展中的作用，鑒定并驗證了在胰腺癌組織中過度表達的5個關鍵基因，包括CXCR4、低氧誘導因子1A（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,HIF1A）、E盒結合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1）、多配體蛋白聚糖 1（syndecan 1,SDC1）和 Twist家族 bHLH轉錄因子 1（twist family bHLH transcription factor 1,TWIST1）。CXCR4、HIF1A、ZEB1和 SDC1在胰腺癌中的表達受 circ-UBAP2和hsa-miR-494調控。CXCR4和ZEB1的表達與CTLA-4和PD-1的表達均呈正相關。這提示circ-UBAP2介導了CTLA-4和PD-1的表達，進而調節免疫細胞的浸潤和功能來調控胰腺癌進展。

2.3.3 胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白（insulinlike growth factor 2 mRNA-binding proteins,IGF2BPs）IGF2BPs屬于RNA結合的癌胚蛋白保守家族。以往的研究證實IGF2BPs在細胞極化、遷移、增殖和分化等多個方面發揮重要作用[38]。Li等[39]發現circNDUFB2充當支架，可增強三結構域蛋白25（tripartite motif containing 25,TRIM25）和IGF2BPs之間的相互作用，此TRIM25/circNDUFB2/IGF2BPs三元復合物通過調節蛋白泛素化和降解以及細胞免疫應答，參與了NSCLC進展過程中IGF2BPs的降解和抗腫瘤免疫的激活。

3 總結與展望

近年來，腫瘤免疫治療尤其是免疫檢查點抑制劑在抗腫瘤治療中得到了成功的應用[40]。然而，僅有小部分患者從腫瘤免疫治療中獲益，腫瘤細胞的免疫耐受阻止了大多數患者從中受益。非編碼RNA尤其是circRNAs引起了越來越多研究者的關注。circRNAs可通過多種機制參與免疫細胞功能的調節和免疫相關分子的表達，也能夠通過作用于免疫檢查點分子在腫瘤免疫逃逸中發揮作用。然而，對circRNAs在腫瘤免疫和治療中發揮的具體生物學功能及其機制尚未明確。但高通量測序技術的成熟和更多免疫相關circRNAs的發現，將為腫瘤免疫治療提供新的方向。