機(jī)械刺激對腱骨愈合影響的研究進(jìn)展

范哲源，孫嘉陽，張云峰，胡高戩，劉澤平，王星星，呂佳音

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)與運動醫(yī)學(xué)，吉林 長春130033)

運動系統(tǒng)功能的實現(xiàn)需要借助多種組織的協(xié)調(diào)活動，包括一些結(jié)締組織，如連接骨與肌肉的肌腱和連接骨與骨之間的韌帶[1-4]。復(fù)雜的結(jié)構(gòu)決定了肌腱與韌帶在人體進(jìn)行活動時其受傷的概率大大增加。大部分前交叉韌帶損傷集中在患者運動中的非接觸性損傷，尤其是滑雪運動中[5-6]。目前關(guān)節(jié)鏡下的前交叉韌帶重建手術(shù)已被大多數(shù)臨床醫(yī)生視為該結(jié)構(gòu)損傷的首選治療方法[7]，在臨床中取得了非常理想的療效。但是腱骨愈合的不成熟導(dǎo)致腱骨界面仍是重建后復(fù)合體中最薄弱的部分[8]。這導(dǎo)致了骨隧道擴(kuò)大、膝關(guān)節(jié)松弛、重建韌帶失效等術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。類似的情況還包括肩袖、后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶等部位的損傷。研究者們發(fā)現(xiàn)多種生長因子(如轉(zhuǎn)化生長因子-β、血管內(nèi)皮生長因子、骨形態(tài)生成蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子、粒細(xì)胞集落刺激因子等)、各種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(如骨髓、脂肪、肌腱等)、各類可降解支架、體外低強(qiáng)度脈沖超聲波等均可以對腱骨愈合產(chǎn)生積極的影響。機(jī)械刺激也是影響腱骨愈合的重要因素之一，但是具體的影響以及發(fā)生機(jī)制仍處于爭議中。機(jī)械刺激在實際的臨床工作中可以以康復(fù)鍛煉的形式表現(xiàn)，盡快開始進(jìn)行康復(fù)鍛煉可以幫助患者提前恢復(fù)肌肉力量和本體感覺，并降低遠(yuǎn)期關(guān)節(jié)僵硬的發(fā)生。但是過早的康復(fù)鍛煉又會使初期較為脆弱的腱骨界面發(fā)生微動，進(jìn)而產(chǎn)生未知的生物學(xué)與組織學(xué)變化。本文對近些年有關(guān)機(jī)械刺激與腱骨愈合的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，以期對臨床治療提供依據(jù)。

1 腱骨愈合的發(fā)生

1.1 天然腱骨結(jié)構(gòu)

肌腱與骨骼之間的連接位點是一種復(fù)雜過渡區(qū)域。在以直接插入作為插入方式的組織，如前交叉韌帶中，天然的腱骨過渡區(qū)是由肌腱、未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨、骨骼的4個區(qū)域構(gòu)成的[9]。在組織學(xué)的研究中可以發(fā)現(xiàn)這一變化是逐漸發(fā)生的，這一結(jié)構(gòu)的剛性會隨著膠原纖維的排列與逐漸發(fā)生的鈣化而增加[10]。而非直接插入的組織，如內(nèi)側(cè)副韌帶中，插入位點則由Sharpey纖維構(gòu)成。這種纖維與肌腱與骨的長軸斜向固定以在兩種組織之間起到錨定[10]。對于韌帶損傷的手術(shù)處理目前大部分選擇將肌腱與骨直接接觸，早期利用瘢痕愈合提供腱骨界面的初始強(qiáng)度，遠(yuǎn)期依靠腱骨愈合以達(dá)到或接近健側(cè)肢體的組織強(qiáng)度。

1.2 腱骨愈合過程

腱骨愈合的過程目前尚未完全明確。過程可能涉及括隧道內(nèi)成骨、新生骨塑形、腱骨界面形成血供、Sharpey 纖維的形成及纖維軟骨鈣化等多個環(huán)節(jié)共同調(diào)節(jié)。最早的愈合階段主要為炎癥反應(yīng)，主要由特定的巨噬細(xì)胞的亞群介導(dǎo)。手術(shù)后4天，從循環(huán)和中性粒細(xì)胞中募集的巨噬細(xì)胞出現(xiàn)在腱骨界面中，并且參與吞噬細(xì)胞碎片，募集額外的炎癥細(xì)胞，并協(xié)助促進(jìn)促炎細(xì)胞因子釋放。在10天后，原本和后產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞可以被區(qū)分出來。這些炎性細(xì)胞將產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，這有助于形成骨隧道與移植物之間的纖維血管瘢痕組織界面。在術(shù)后前8周，肌腱骨界面發(fā)生免疫組織學(xué)變化，此時表面出現(xiàn)巨噬細(xì)胞與骨髓衍生的干細(xì)胞的浸潤。最初，該界面主要含有Ⅲ型膠原蛋白，并產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等生長因子，刺激抗血管生成和成纖維細(xì)胞的生成。同時骨隧道開始了隧道壁的細(xì)胞骨化和軟骨細(xì)胞生成，這一過程中減少了肉芽組織并產(chǎn)生了Ⅱ型膠原蛋白。肉芽組織逐漸被骨組織和軟骨細(xì)胞替代。同時，隧道和移植物之間的剪切應(yīng)力導(dǎo)致產(chǎn)生更多的夏普氏纖維，并從移植物的邊緣表達(dá)FGF，吸引成纖維細(xì)胞進(jìn)入移植物中并產(chǎn)生Ⅲ型膠原蛋白。在增殖階段期間干細(xì)胞發(fā)生增殖和分化，新生骨骼慢慢成形，復(fù)合物強(qiáng)度也隨之改善。隨著肌腱移植物和骨骼之間膠原纖維的連續(xù)性、細(xì)胞性和血管性的降低，腱骨界面逐漸完成移植物的重塑。

2 不同手術(shù)模型對于腱骨愈合的不同響應(yīng)

2.1 非骨隧道內(nèi)模型

Hettrich等人構(gòu)建了將小鼠髕腱離斷后重新將其附著在天然足印區(qū)的動物模型[11]。術(shù)后對腱骨復(fù)合物施加機(jī)械負(fù)載，以施加負(fù)載的開始時機(jī)和負(fù)載強(qiáng)度作為因變量，分為固定組，立即負(fù)荷組，低負(fù)荷延遲4天組，低負(fù)荷延遲10天組，高負(fù)荷延遲4天組，高負(fù)荷延遲10天組。之后選擇多個時間點將小鼠處死，進(jìn)行組織學(xué)、免疫組化、影像學(xué)和生物力學(xué)等相關(guān)分析。最終結(jié)果提示術(shù)后固定可以形成機(jī)械強(qiáng)度更強(qiáng)，組織排列更好的腱骨界面，固定組在4、10、21天時具有更好的膠原纖維組織；在10、21、28天時有著更低的MMP-13的表達(dá)；所有時間點都較少的凋亡細(xì)胞；4和28天時更少的IL-1B。這些結(jié)果表明固定處理可以形成強(qiáng)度更高的腱骨復(fù)合物，改善了腱骨界面的結(jié)構(gòu)和組成。Zhang等人研究顯示出與上述相似的結(jié)果[12]。在使用單側(cè)岡上肌肌腱離斷后再修復(fù)的模型中，該實驗分為術(shù)后立即隨意活動組和7天后跑步機(jī)活動組。結(jié)果顯示跑步機(jī)組在4周時在新生骨量與腱骨復(fù)合物強(qiáng)度的表現(xiàn)上均優(yōu)于對照組，8周時2組之間的差異較小。隨后研究者又進(jìn)行了定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和免疫熒光染色實驗，提示在肩袖損傷后修復(fù)的模型中，機(jī)械刺激可能通過增加降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、P物質(zhì)(SP)和外周神經(jīng)肽Y(NPY)等的表達(dá)來促進(jìn)腱骨愈合。Wada等人選擇類似的小鼠岡上肌模型比較術(shù)后固定與術(shù)后負(fù)荷組，結(jié)果提示過度負(fù)荷可能由于影響了Ihh和 Wnt/β-Catenin通路的活化，導(dǎo)致腱骨界面強(qiáng)度下降[13]。以上的研究提示在肌腱直接附著在骨骼上的手術(shù)模型中早期較長時間的固定對于提高復(fù)合體的失效負(fù)荷，新生骨的體積等方面有積極意義。

2.2 骨隧道內(nèi)手術(shù)模型

移植物在骨隧道內(nèi)的愈合可能與其受力的方式有關(guān)。有人將雌性日本白兔的趾長伸肌腱的近端游離，然后將肌腱與脛骨長軸垂直方向穿過骨隧道，將動物于6、8、12、24周時處死再進(jìn)行組織學(xué)分析。結(jié)果顯示拉伸力可以增強(qiáng)腱骨界面的再生，壓力可以促進(jìn)纖維軟骨的形成，而剪切力對于腱骨愈合似乎沒有影響[14]。與之采用類似的方法對移植肌腱進(jìn)行固定的另一組實驗在實施過程中加入了間充質(zhì)干細(xì)胞或新鮮骨髓，實驗結(jié)果表明加入了新鮮骨髓的組別出現(xiàn)了生物力學(xué)強(qiáng)度更高，更多新鮮骨形成的腱骨界面[15]。這似乎與更多的M2巨噬細(xì)胞和更少的M1巨噬細(xì)胞表達(dá)有關(guān)。Rodeo等人則使用了忽略剪切力和壓力，以拉伸力為主要研究的出發(fā)點，將小鼠分為固定組，低應(yīng)力組與高應(yīng)力組[16]，結(jié)果顯示低應(yīng)力組在3周時顯示出更高的失效負(fù)載，但是這種生物力學(xué)上的優(yōu)勢在6周時不復(fù)存在，而固定組在3、6周時都表現(xiàn)出更高的骨體積分?jǐn)?shù)。

前交叉韌帶重建是最常應(yīng)用的骨隧道手術(shù)模型[17-19]，所以更多的研究者選擇了以前交叉韌帶重建為模型的動物實驗，以期尋找術(shù)后機(jī)械負(fù)載對于腱骨愈合的影響[20-22]。為了尋找不同等級的機(jī)械負(fù)載對腱骨愈合的影響，Ma等人對小鼠的前交叉韌帶重建模型的股骨隧道進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而改變隧道內(nèi)移植物的受力[22]。最終的結(jié)果顯示固定化對于腱骨復(fù)合物的骨形成有積極的影響，而較低應(yīng)力的刺激對于遠(yuǎn)期提升腱骨復(fù)合物強(qiáng)度有幫助，高應(yīng)力刺激可能由于更多的破骨細(xì)胞表達(dá)從而延遲腱骨愈合。有研究者從康復(fù)的角度用兔子模型模擬人在前交叉韌帶重建術(shù)后進(jìn)行CPM鍛煉。結(jié)果顯示經(jīng)歷兩周CPM訓(xùn)練的組別有著更多的纖維軟骨生成，更多的膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、堿性磷酸酶、肌腱蛋白C等前體物質(zhì)的表達(dá)，從而提升了腱骨復(fù)合物的強(qiáng)度，體外培養(yǎng)的結(jié)果與動物實驗的結(jié)果相似，佐證了機(jī)械刺激對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肌腱細(xì)胞的影響。當(dāng)以術(shù)后開始進(jìn)行機(jī)械負(fù)荷的時間作為變量時，一定的固定時間之后再進(jìn)行活動在腱骨愈合過程中更具優(yōu)勢[20]。這種固定時間似乎與隧道外模型有所不同，較短時間的固定輔以低應(yīng)力的刺激可以在遠(yuǎn)期展現(xiàn)出更加穩(wěn)定的腱骨界面，但是暫時無法將最佳的負(fù)荷時間同步應(yīng)用到人類的康復(fù)過程中。

2.3 兩種類型模型產(chǎn)生差異的可能原因

不同的模型產(chǎn)生了不同的愈合效果，在移植物以附著的方式與骨骼相接觸的模型中，無機(jī)械刺激的腱骨界面有著更具優(yōu)勢的愈合，而當(dāng)移植物在骨隧道中時，早期較低強(qiáng)度的刺激和較短的固定時間均可以提高腱骨復(fù)合物的生物力學(xué)強(qiáng)度與組織連續(xù)性。

機(jī)械刺激可以促進(jìn)TGF-β的表達(dá)，這一細(xì)胞因子的兩個亞型(TGF-β1，TGF-β3)均與腱骨愈合有密切聯(lián)系[23-26]。TGF-β3可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成，顯著增強(qiáng)腱骨界面的結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能，在胎兒和新生兒環(huán)境中促進(jìn)皮膚傷口和肌腱愈合并不形成疤痕。同時TGF-β3對于愈合過程的加速效應(yīng)也是明顯和全程的。遺憾的是，TGF-β3未在成人的肌腱愈合中發(fā)現(xiàn)。而另一亞型TGF-β1同樣影響著腱骨愈合。Wang等人對于TGF-β與腱骨愈合之間的關(guān)系有著更加深入的研究。在對新西蘭白兔行前交叉韌帶重建術(shù)后6周，TGF-β過表達(dá)組形成了更加明確的軟骨區(qū)域，而即使在12周后抑制組中肌腱與骨骼仍未形成有效的連接。三維CT的結(jié)果也提示TGF-β過表達(dá)組可能促進(jìn)更多的新骨形成從而降低術(shù)后骨隧道擴(kuò)大的發(fā)生[27]。另一方面，機(jī)械刺激對于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)同樣具有加強(qiáng)增殖、分化同時抑制凋亡的調(diào)節(jié)[28]。TGF-β同時又可以對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)產(chǎn)生募集作用，兩者均受機(jī)械刺激的正向調(diào)控，并都對腱骨愈合產(chǎn)生促進(jìn)作用。但是這種愈合優(yōu)勢在早期可能會被過多的瘢痕組織所影響進(jìn)而降低遠(yuǎn)期復(fù)合物之間的愈合。在穿過骨隧道的模型中由于受到更多骨髓組織的影響，機(jī)械刺激對于BMSC的促進(jìn)作用會被放大，這與僅僅附著在骨表面的模型是截然不同的。猜測可能造成了以類似肩袖損傷后修復(fù)為原型的動物模型中機(jī)械刺激對于腱骨愈合的負(fù)面結(jié)果。深層次的原因需要更多的實驗研究去證實。