砷化合物抗腫瘤多藥耐藥性作用及作用機制研究進展

王 貴 ，鄔 俊 ，李 雙 ，陳 毅 ，姜 爽 ，王曉波

（1. 大連醫科大學藥學院，遼寧 大連 116044； 2. 中國人民解放軍聯勤保障部隊第967 醫院，遼寧 大連 116021）

多藥耐藥性（MDR）是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現耐藥性的同時，對其他多種結構不同、作用靶位不同的抗腫瘤藥物也有耐藥性。隨著腫瘤化學治療（簡稱化療）藥物在臨床的廣泛應用，抗腫瘤藥物腫瘤耐藥性問題也越來越突出，已成為化療失敗的重要原因［1］。目前的治療手段包括采用西藥類抗腫瘤MDR 藥物維拉帕米、他莫昔芬、環孢素 A 等［2－3］，中藥類抗腫瘤MDR 藥物三七總皂苷、白藜蘆醇（RSV）、甲基蓮心堿、雄黃等［4］，納米載體藥物和光動力治療等。但抗腫瘤MDR 的西藥類藥物毒副作用較大，不宜長期應用，且部分藥物價格昂貴，限制了臨床的廣泛應用。研究發現，砷化合物包括有機砷化合物、三氧化二砷（ATO）、五氧化二砷、砷酸、亞砷酸、亞砷酸鈉（NaAsO2）、硫化砷、三硫化二砷、雄黃等治療腫瘤療效顯著，且能逆轉腫瘤MDR。現對近年來砷化合物對腫瘤MDR 的作用及作用機制研究進展綜述如下。

1 在細胞水平對腫瘤MDR 的作用及作用機制

1.1 抑制耐藥性腫瘤細胞血管再生和轉移

腫瘤組織依靠新生血管維持自身的營養供應，抑制腫瘤血管生成可最大限度達到“餓死腫瘤”的目的。蔣碧佳等［5］用ATO 聯合維生素C 對人耐藥肺腺癌裸鼠移植瘤模型進行干預，發現ATO 能抑制耐藥性肺癌移植瘤血管內皮生長因子（VEGF）的表達，促進細胞凋亡。LIANG 等［6］研究發現，3.2 μmol／L 的 ATO 可顯著抑制MDR 白血病（K562 ／AO2）細胞的增殖，并下調 K562 ／AO2細胞中 VEGF 的表達水平，逆轉 K562／AO2 細胞的MDR。SONG 等［7］通過免疫組織化學染色法和藻酸鹽包封的腫瘤細胞測定法發現，雄黃轉化溶液（RTS）抑制VEGF 誘導的VEGFR2和下游蛋白激酶［胞外信號調節激酶（ERK）、黏著斑激酶（FAK）、非受體酪氨酸激酶 C（SRC）］的磷酸化，阻斷了血管生成作用。

1.2 抑制耐藥性腫瘤細胞侵襲和遷移

ATO 對耐藥人上皮性卵巢癌細胞系（3AO／CDDP）細胞的生長抑制率呈劑量和時間依賴性，較低濃度的ATO 可干擾細胞進入S／G2期，較高濃度可選擇性地誘導 S 期細胞凋亡，抑制 3AO ／CDDP 的增殖和轉移［8］。陳飛研［9］通過引入負載紫杉醇的亞砷酸釓納米顆粒（HPAN）來克服紫杉醇的MDR。其中，紫杉醇與亞砷酸釓納米顆粒形成棒狀混合簇，由內源性無機磷酸鹽促使HPAN 結構崩塌，釋放出紫杉醇和ATO。HPAN 對耐紫杉醇的人結直腸癌細胞系（HCT166）體內抗癌試驗證明，HPAN 對異種移植小鼠模型中的抗性腫瘤作用優于原始紫杉醇或等劑量紫杉醇和ATO 的混合物。ATO 與阿霉素（ADM）聯合可下調磷酸化促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）1 和 β 聯蛋白 （β －catenin），上調磷酸化MAPK8 和上皮鈣黏素，抑制耐阿霉素的人骨肉瘤（MG63 ／dox）細胞遷移和侵襲［10］。

1.3 誘導腫瘤MDR 細胞發生自噬

自噬可防止應激時有毒或致癌的蛋白質和細胞器積累，抑制細胞癌變。腫瘤一旦形成，自噬可為癌細胞提供更豐富的營養，促進腫瘤生長，避免藥物或輻射損傷，產生耐藥性［11］。研究表明，增強自噬組織蛋白（Beclin－1）凋亡途徑是克服抗癌藥物耐藥性的有效方法［12］。CHENG 等［13］研究發現，ATO 可作為白血病 K562 及其耐藥株K562／ADM 細胞中自噬的有效誘導劑，提高 K562／ADM 細胞Beclin － 1 的表達水平，降低凋亡基因 B 細胞淋巴瘤 2（Bcl － 2）mRNA 及蛋白表達水平，促進自噬細胞死亡。口服納米硫化砷（ee －As4S4）作用慢性粒細胞白血病（CML）患者骨髓中的 K562，K562 ／AO2 和原代細胞，發現 ee － As4S4可通過下調細胞內活性氧（ROS）和低氧誘導因子1α 的水平誘導上述細胞自 噬［14］。

2 在分子水平對腫瘤MDR 的作用及作用機制

2.1 抑制耐藥相關蛋白表達

糖蛋白（P－gp）過表達是引起細胞多藥耐藥的主要原因［15］。研究表明，ATO 孵育 K562 ／AO2 細胞 48 h 和72 h 后，3.2 μmol／L ATO 可顯著降低 K562 ／AO2 細胞中 P － gp 的表達水平［6］，且 P － gp 的下調有助于降低ATO 對抗 ADM 胃癌細胞的耐藥性［16］。1 μmol／L ATO處理 K562 ／RA 細胞 4 d 后，P － gp 的表達水平下降，熒光強度降低。提示ATO 可通過抑制P－gp 的表達減弱對藥物的消除作用，延長K562／D 細胞內藥物的釋放時間［17］。王欣［18］發現，RST 具有更強的靶向性，可快速、有效蓄積在耐藥白血病細胞中，顯著降低K562／ADM 細胞中P－gp 的表達水平。ATO，As4O6與順鉑的組合可在耐紫杉醇的癌細胞系中產生協同作用，通過誘導切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cleaved caspase）3 的表達，抑制對紫杉醇耐藥的卵巢癌細胞系的細胞生長，并誘導其凋亡［19］。

ATO 通過下調多藥耐藥關聯蛋白（MRP）1 的表達水平，降低膜轉運蛋白活性，導致細胞內藥物蓄積，抑制膀胱癌細胞（BIU －87）中 P －gp 和 MRP1 的表達，最終逆轉腫瘤細胞的耐藥抗藥性［20］。RSV 和 ATO 聯合治療耐阿霉素的K562 白血病細胞，發現聯合用藥主要降低P －gp，MRP1 和 B 細胞受體（BCR）耐藥相關蛋白，抑制耐藥白血病細胞的生長［21］。丁硫氨酸亞砜亞胺（BSO）與ATO 聯用可通過抑制MRP1 及其編碼基因mRNA 的表達誘導 K562 ／ADM 細胞凋亡［22］。靶蛋白 SET 的表達和功能調控在對視黃酸具有抗藥性的急性早幼粒細胞白血病（APL）中有潛在的治療作用。TIAN 等［23］研究發現，As4S4誘導的凋亡伴隨抗維甲酸急性早幼粒細胞白血病細胞（NB4－R1）中 SET 基因的 mRNA 和蛋白表達水平降低。

2.2 抑制耐藥酶谷胱甘肽 S 轉移酶（GST－π）和Topo－Ⅱ表達

GST－π 是GST 家族中關系最密切的Ⅱ期解毒酶，主要作用包括催化藥物降解，促進藥物代謝，降低抗腫瘤藥物的細胞毒性，其表達水平與腫瘤耐藥性成正比［24］。DNA 拓撲異構酶（Topo）Ⅱ是人體內重要的核酸酶，參與DNA 轉錄、翻譯、復制、染色體分離等遺傳過程，主要發生在 S － G2／ M 期。ZHAO 等［25］研究表明，ATO 可促進耐藥腫瘤細胞中Topo－Ⅱ表達，抑制GST－π 表達，0.8 μmol／L 的 ATO 可通過抑制 P － gp 來提高耐阿霉素胃癌細胞（SGC7901 ／ ADR）對 ADM 的敏感性，抑制GST － π 表達，并增加阿霉素在 SGC7901 ／ADR 細胞中的積累，部分逆轉SGC7901／ADR 細胞對阿霉素的耐藥性［26］。

2.3 下調血清微管解聚蛋白（Stathmin）表達

Stathmin 作為一種新的腫瘤標志物，有多種生物學功能，與多個系統的腫瘤都有關聯，并呈現高表達［27］。ATO 與ADM 聯用通過下調Stathmin 而逆轉MG63／dox對阿霉素的耐藥性［28］。

3 在基因水平對腫瘤MDR 的作用及作用機制

3.1 抑制凋亡控制基因表達

LI 等［29］研究發現，ATO 可下調凋亡抑制蛋白生存素（Survivin）的表達水平，抑制癌細胞多藥耐藥性。ZAKI DIZAJI 等［30］分析了不同階段（診斷、緩解和復發）的 50份外周血和19 份骨髓樣品中Survivin 基因的表達水平，發現ATO 抑制了Survivin 基因的表達。同時，ATO聯合RSV 干預K562／RA 白血病細胞，協同抑制了Bcl－2、核轉錄因子κB（NF－κB）和p53 的表達，增強了耐藥性白血病細胞對細胞凋亡的敏感性［21］。WANG 等［31］發研究現，As4S4通過阻斷細胞周期 S 期和 G2／M 期 NB4－R1細胞發揮細胞毒性作用。流式細胞術檢測結果發現，隨著 As4S4誘導 NB4－ R1細胞在 S 期和 G2／M 期的積累，As4S4通過 Bcl－2 和 BAX 的改變、Caspase － 3 的激活誘導細胞凋亡。2 μmol／L ATO 可下調 Bcl－2 的表達水平，選擇性抑制對順鉑耐藥上皮性卵巢癌細胞（CI80－13S）的生長，并誘導細胞凋亡［32］。

3.2 抑制NF－κB

NF－κB 是一種多功能的轉錄因子，參與調控免疫炎癥、細胞增殖、分化和凋亡；也是腫瘤細胞轉移和耐藥性的關鍵調節因子。因此，控制NF－κB 的活性將為增強腫瘤細胞化療敏感性，逆轉腫瘤細胞耐藥提供新的策略［33］。ATO 通過誘導DNA 脫甲基化激活了microRNA－148a（miR－148a），通過靶向 p65 的 3′－UTR 抑制了 NF－κB途徑，抑制CSC 表現型，降低肝細胞癌（HCC）的化學耐藥性［34］。QIU 等［35］通過免疫染色，采用免疫沉淀法和原子熒光光譜法等發現，14 － 3 － 3η ／ NF － κB 反饋回路在維持肝癌耐藥性表型中起重要作用，ATO 可抑制14－3－3η ／NF－κB 反饋回路，逆轉 HCC 的化學耐藥性。RSV 和ATO 聯合治療可通過抑制NF－κB 信號通路而誘導 K562 ／RA 細胞凋亡［21］。

3.3 下調 MDR1 基因

MDR1 基因負責編碼P－gp，其過度表達是腫瘤細胞多藥耐藥的主要原因。有研究表明，ATO 能抑制白血病細胞 MDR1 基因的表達，逆轉白血病耐藥性［36］。WANG 等［37］用 雄黃轉化 液處理 K562 ／ADM 細 胞 4 h后，細胞內砷的蓄積分別比As4S4或ATO 處理的細胞高2 倍和 16 倍，MDR1 mRNA 和 P － gp 的表達水平下降。RSV 通過促進ATO 的增殖作用可增強K562／RA 細胞對ATO 的敏感性，降低耐藥基因MDR1 的表達水平，最終提高 K562／RA 細胞對細胞凋亡的敏感性［21］。

3.4 協同DNA 損傷和干預DNA 修復

大多數抗腫瘤藥物可直接或間接破壞腫瘤細胞的DNA，干擾DNA 修復。研究表明，DNA 的損傷與原發性耐藥密切相關［38］。載有砷的雙重藥物（阿霉素和ATO）納米藥物系統具有顯著的藥物協同作用和pH 觸發藥物釋放，可有效治療抗阿霉素的肝細胞癌細胞（HuH－7／ADM）。該納米藥物系統具有阿霉素對DNA 損傷的協同作用及ATO 對DNA 修復的干擾，對抗阿霉素癌細胞產生了極高的殺傷效率［39］。載有順鉑和ATO 的納米復合物經基因表達譜發現，處理后的原癌基因和DNA 損傷修復相關基因MYC，MET，MSH2 的表達減少，腫瘤抑制基因PTEN，VHL，FAS 表達的增加，有效地克服了腫瘤的耐藥性［40］。將人上皮性卵巢癌（EOC）細胞在 37 ℃ 或 39 ℃下用順鉑和 20 μmol／L NaAsO2處理 1 h，調節 DNA 損傷反應使表達 p53 的 EOC 對順鉑敏感［41］。

4 促進耐藥性腫瘤細胞凋亡的信號通路

4.1 膜受體酪氨酸蛋白激酶信號傳導途徑（RAS／RAF ／MAPK）信號通路

RAS ／RAF ／MAPK 是調控細胞增殖、分化、凋亡的重要信號通路。耐藥胃癌細胞具有較高的P－gp 和RAS表達水平，無毒和中等毒性的ATO 通過RAS／磷酸化胞外信號調節激酶（p－ERK）1／2 信號途徑降低胃癌細胞對 ADM 的耐藥性［16］。低劑量（＜ 2 μmol／L）ATO 可通過 RAS／RAF／MAPK 信號途徑上調脂肪酸合成酶（FAS）和 NM23H1 基因，下調 N － MYC 和 MTA1 基因，抑制人卵巢癌細胞耐藥細胞的生長和增殖能力［8］。劉寶玲［42］通過體外試驗發現，ATO 可下調 RAS ／p － ERK 信號傳導通路中RAS 和p－ERK 的表達水平，逆轉胃癌細胞耐藥性。亞砷酸可異常地高度激活p38 MAPK 通路 ，NaAsO2、加 馬 布 他 汀 和 p38 MAPK 抑 制 劑SB203580聯合對抗膠質母細胞瘤，防止腫瘤復發和耐藥性的持續發展［43］。

4.2 磷脂酰肌醇激酶／蛋白激酶B（PI3K－AKT）信號通路

PI3K／AKT 信號通路是一條酪氨酸激酶級聯信號傳導通路，可促進細胞生長增殖，參與腫瘤的發生、發展［44］，影響細胞的增殖分化。WANG 等［45］發現 As4S4通過抑制AKT 和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激酶的活性而增加As4S4誘導的細胞凋亡和自噬。As4S4和谷胱甘肽（GSH）合成酶抑制劑 L－丁硫氨酸 －（S，R）－亞磺酰亞胺（BSO）聯合治療可協同抑制PI3K／AKT 信號逆轉人乳腺癌中砷的耐藥性［46］。單獨使用ATO 或與PI3K／AKT 信號通路抑制劑LY294002 聯合處理急性粒細胞白血病（AML）細胞后，黏附于基質的AML 細胞對ATO的敏感性顯著降低，AML 的抗藥性部分消除［47］。

4.3 內質網應激（ERS）反應

ERS 與腫瘤耐藥密切相關。CHEN 等［48］研究發現，ATO 對白血病K562／ADM 耐藥細胞有較高的凋亡誘導作用，可明顯提高內質網伴侶78KDA 葡萄糖調節蛋白（GRP78 ／BIP）的表達水平。

4.4 Notch 信號通路

Notch 通路在調節干細胞增殖、分化、凋亡、黏附、耐藥等方面起重要作用。研究表明，ATO 能抑制Notch－1的表達，抑制 HEPG2細胞的增殖和遷移［49］。楊莉等［50］研究發現，Notch－1 信號通路的異常，參與了 HEPG2／ADM細胞耐藥性的產生，抑制Notch－1 通路能有效抑制HEPG2／ADM 細胞的耐藥性。

5 結語

砷化合物聯用其他藥物抗腫瘤MDR 的作用機制涉及多因素、多基因、多水平、多結構的復雜過程。對于藥物抗腫瘤MDR 治療的研究，如ATO 注射液通過體內外試驗，在細胞、分子和基因水平對腫瘤MDR 療效均較好；在基因水平，亞砷酸鈉可調節DNA 的損傷和修復；在分子水平，雄黃可誘導耐藥腫瘤細胞發生自噬，在基因水平抑制凋亡基因Bcl－2 和MDR1 的表達水平，從而抑制PI3K／AKT 信號通路。

砷化合物聯合其他藥物在抗腫瘤MDR 方面療效更佳，可降低毒副反應，提高藥物療效。如ATO 與ADM聯合抑制耐藥性腫瘤的侵襲和遷移，下調Stathmin；與RSV 聯用可調節耐藥性腫瘤基因的表達，抑制NF－κB信號通路。As4S4與BSO 聯用抑制耐藥性腫瘤的PI3K／AKT信號通路，提高治療效果。除ATO 和As4S4外，其他砷化合物臨床應用范圍也在擴大，目前已有亞砷酸聯合沙利度胺、維生素C 治療有明顯耐藥性的多發性骨髓瘤患者的臨床療效顯著［51］。有機砷、氯化砷、砷酸和五氧化二砷等砷化合物抗腫瘤MDR 的研究不斷增多，但尚缺乏作用機制研究，包括藥物靶標、端粒酶、HEDGEHOG 通路、骨形態發生蛋白質通路、WNT／β－catenin 通路等。